巨噬细胞在骨腱界面损伤修复中的作用*

徐子涵， 李声灿， 吕红斌， 张 涛

中南大学湘雅医院运动医学科，器官损伤衰老与再生医学湖南省重点实验室，长沙 410008

目前，全民健身运动在我国广泛开展，各类运动损伤人数也不断增加[1]。骨腱界面(bone-tendon interface，BTI)损伤是一类非常常见的运动系统创伤性疾病，特别是以肩袖损伤和交叉韧带损伤为代表的骨腱界面损伤，具有较高的发病率和致残率，严重影响患者的生活质量[2]。在美国每年有超过27万例肩袖损伤患者需要手术修复，同时，肩袖损伤术后再撕裂发生率居高不下，如单纯冈上肌腱损伤修复术后的再撕裂率约为25%，巨大肩袖损伤修复术后的再撕裂率高达75%[3-4],给患者带来巨大痛苦，甚至使其丧失劳动能力。目前骨腱界面损伤修复的研究多聚焦于干细胞和生物材料方面，却忽略了干细胞以及生物材料所处微环境的作用。作为炎症反应过程中具有递呈抗原和吞噬作用的重要细胞，巨噬细胞在机体发生炎症反应时，迅速汇聚至病灶区域，参与组织损伤的修复，被认为是机体损伤修复局部微环境调控的核心[5-7]。本文将结合骨腱界面的连接类型、巨噬细胞的来源及极化对巨噬细胞在骨腱界面修复中的作用进行阐述。

1 骨腱界面的连接类型及其修复

骨腱界面连接存在两种方式，即纤维软骨性连接和纤维性连接[8]。

纤维软骨性连接又称为直接连接，是肌腱附着于骨时形成空间梯度渐变的连接结构，经典的纤维软骨性骨腱界面由4部分组成：肌腱、未钙化纤维软骨、钙化纤维软骨和骨。这种结构利于肌肉收缩产生的力在骨与软组织间有效缓冲传递，避免应力集中[9]。在钙化纤维软骨层与未钙化纤维软骨层之间存在一条连续的分界区，称为潮线(tidemark)。相比腱-腱断裂修复和骨-骨断裂修复，这种涉及到的骨、纤维软骨、肌腱的多层过渡结构的修复更为复杂[10]。另外，该部位血供差且再生能力弱，严重创伤后其形态学结构和生物学特性几乎不可能恢复至损伤前水平[11]。前期研究发现兔髌骨-髌腱界面损伤后16周再生的纤维软骨层厚度仅达到正常的50%左右[12-13]，国内外学者的系列研究也证实骨腱界面损伤后纤维软骨层的再生情况与其损伤修复质量密切相关[14-15]。因此，明确骨腱界面损伤后纤维软骨层再生的机制至关重要。

纤维性连接又称为间接连接，是肌腱通过Sharpey纤维直接与骨膜连接的方式，没有纤维软骨层的介入，一般发生在长骨骨干位置。这种特殊的连接方式能分散纵向拉力和侧向剪切力，使单个胶原束应力最小化[16]。在运动医学研究领域，间接连接一般出现在移植物肌腱与骨隧道间[17]。Shen等[18]通过对兔行前交叉韧带重建术并采取悬吊式固定探讨悬吊固定的骨隧道肌腱愈合模式及骨诱导磷酸钙陶瓷(osteoinductive calcium phosphate ceramics，OICPC)对修复愈合的影响。其中对照组未经OICPC处理，术后修复过程中出现新骨生成，直至12周时部分切片观察到sharpey纤维，但未见到经典四层结构的直接连接方式；而OICPC组在12周时几乎所有标本均存在间接连接，且其中有2个标本同时还出现了经典四层结构的直接连接方式。

此前，国内外已有研究表明，移植物的固定方式、骨的性质、骨隧道的长度及半径等因素均可影响骨隧道内骨腱界面的修复[19-21]，而何种条件下骨腱界面以间接连接方式或直接连接方式修复，间接连接修复和直接连接修复的过程是彼此独立还是相互转化的，目前还有待进一步的观察和研究。

2 巨噬细胞的来源及极化

巨噬细胞主要包括由造血干细胞经单核细胞分化而来的巨噬细胞和定植于局部组织的定居巨噬细胞(tissue-resident macrophages，trM)[22]。当机体未受到侵害时，胚胎源性的组织定居巨噬细胞在组织中不断进行自我更新并维持内环境稳定。然而，当感染和组织损伤造成组织定居巨噬细胞大量消耗时，原有的组织定居巨噬细胞分泌趋化因子、趋化蛋白如白细胞介素-10(IL-10)、细菌脂多糖(LPS)等，活化并募集循环血液中的单核细胞穿过血管内皮参与组织定居巨噬细胞的长期重建[6，23]。募集而来的巨噬细胞具有很强的可塑性，这种可塑性表现在通过改变自身表型和生理特征来改变和适应不同微环境[24-25]，这种形态和功能随不同微环境刺激而显著改变的过程称为极化。根据功能的不同，巨噬细胞主要可分为M1型经典活化(classically activated)巨噬细胞和M2型选择性活化(alternatively activated)巨噬细胞，分泌不同的炎症因子，包括促炎因子和抗炎因子，而炎症因子是骨腱界面微环境至关重要的组成部分[26-27]。巨噬细胞在干扰素-γ(IFN-γ)、LPS和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等因子刺激下极化成为M1型巨噬细胞，分泌促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ)、活性氧(ROS)、氮中间产物、趋化因子(CXCL9、CXCL10)等，在急性炎症早期主要发挥吞噬功能，清理损伤部位内环境，参与Th1免疫应答。巨噬细胞在白介素(IL-4、IL-10、IL-13)、转化生长因子-β(TGF-β)等刺激下，可向M2型巨噬细胞极化并分泌一些抗炎因子(TGF-β、IL-4、IL-10)和促血管生成因子[如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)]等，在炎症反应后期参与Th2免疫应答，下调炎症反应，通过促进损伤部位血管再生及组织重建，加快修复进程[28-29]。损伤修复过程中，M1、M2型巨噬细胞的相继出现是巨噬细胞极化的动态变化过程还是新血源性单核细胞的加入，仍是一个有争论的话题[30]。

目前，巨噬细胞的极化机制尚未完全明确。近些年研究表明，细胞代谢通路可能是巨噬细胞感知微环境及形态功能改变的基础，巨噬细胞通过与基质细胞的双向沟通，进行糖酵解代谢重编程、调节三羧酸循环的代谢水平，进而改变自身线粒体功能，调节巨噬细胞的活化及可塑性[31-32]。目前已知的分子机制包括JAK/STAT信号通路、Notch信号通路、IRF信号通路等，一些研究表明miRNA及lncRNA也在极化中起到一定作用[33-36]。

3 巨噬细胞在骨腱界面损伤修复中的作用

3.1 纤维软骨性骨腱界面

纤维软骨性骨腱界面修复过程大致可分为4个阶段：起始的炎症反应期、新生骨形成与纤维软骨样结构的再生期、编织骨重塑与再生纤维软骨层成熟期、最终的重塑期[37]。纤维软骨层再生经历着炎症期局部坏死组织降解、再生期干细胞迁移及定向分化、重塑期胶原纤维重排与纤维软骨细胞成熟等变化。Raggatt等[38]在Fas诱导巨噬细胞凋亡的转基因小鼠骨折模型中发现，骨折修复的启动需要巨噬细胞的参与，巨噬细胞对骨折修复具有实质性和长期的贡献。同样，巨噬细胞在骨腱界面修复的整个过程中也扮演着重要的角色[18]。在肩袖急性损伤模型中，氯磷酸二钠脂质体局部清除损伤界面巨噬细胞后，可观察到低强度脉冲超声对骨腱界面损伤的促修复作用减弱甚至消失[39]。

3.1.1 起始炎症反应期 纤维软骨性骨腱界面损伤的急性期以腱止点处肌腱的全部或部分断裂为主要特征，早期表现为明显的充血肿胀。修复开始阶段主要表现为骨腱界面炎症细胞的浸润，组织定居巨噬细胞分泌趋化因子、促炎因子等，招募并极化更多的血源性单核细胞以及组织定居巨噬细胞至损伤部位。在此阶段，主要的巨噬细胞为M1型巨噬细胞。M1型巨噬细胞产生TNF-α等炎症反应初期启动因子，诱发IL-1β、IL-6、IFN-γ和其他炎症因子的释放，激活免疫反应，可以有效清除细胞碎片及坏死细胞，防御病原体感染。但是，如果巨噬细胞介导的炎症反应没有在适当的时期终止，可能会导致组织的损伤，往往预示着不良结局，比如组织纤维性愈合，与周围组织发生粘连，限制肌腱的滑动。有研究表明，骨腱界面损伤后早期制动至关重要，可避免因肢体活动导致组织的进一步损伤及炎症期的延长，促进愈合，但其机制是单纯加快炎症性巨噬细胞的消退还是减少了组织细胞的凋亡坏死，目前尚无定论[40-41]。

3.1.2 新生骨形成与纤维软骨样结构的再生期 在纤维软骨再生期，损伤的骨腱界面出现新生骨和纤维软骨样结构。新生骨组织与正常骨组织相比，骨髓腔小而多，骨髓腔内骨细胞数量较多，无软骨细胞和胶原纤维。新生纤维软骨样结构与正常纤维软骨相比，胶原纤维束交错排列，软骨细胞小而少，分布于纤维束之间。巨噬细胞在该阶段的极化混杂，有M1和M2两种，通过释放细胞因子调节成纤维细胞、成骨细胞、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)等细胞的募集、增殖与分化，为骨腱界面的修复提供“材料”[42]。M1型巨噬细胞在清理坏死组织细胞的同时，也被认为参与组织修复，其主要作用是招募干细胞、促进干细胞迁移至损伤部位。M2型巨噬细胞则促进干细胞存活、定向成骨分化[43]。有研究表明，巨噬细胞分泌的这些细胞因子中TGF-β在骨腱界面修复中起着重要调节作用[44]。TGF-β可促进成纤维细胞以及成骨细胞的募集和增殖，而成纤维细胞产生的新胶原蛋白基质有利于损伤部位及周围软组织对VEGF的附着[45]，VEGF可通过促进血管内皮细胞增殖，为纤维软骨层再生提供营养基础，促进骨腱界面损伤处血管的新生。成骨细胞则是构成新生骨的重要细胞，其通过合成分泌糖蛋白和胶原促进骨基质形成，并钙化基质形成骨组织。研究表明，巨噬细胞能够通过分泌TGF-β招募干细胞至损伤部位[46]，并调控干细胞的成骨分化能力[47]。巨噬细胞分泌的另外一种细胞因子骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)，对肌腱干细胞(tendon derived stem cells，TDSCs)具有很强的分化诱导活性，BMP-2可诱导TDSCs向成骨、成脂、成软骨方向分化[48]，从而促进骨腱界面的修复。近期，Zhang等[49]发现巨噬细胞来源的神经营养因子-3(neurotrophin-3，NT-3)可能通过ERK1/2和PI3K/Akt信号通路促进TDSCs的异位骨化(heterotopic ossification，HO)形成和成骨作用。

3.1.3 编织骨重塑与再生纤维软骨层成熟期 随着修复的进展，骨腱愈合界面编织骨逐步成熟，自损伤面向远端肌腱长入。界面区域可见大量软骨细胞，并且细胞沿着骨腱纵轴方向排列，软骨细胞呈灶状分散在钙化灶内，最终于两组织交汇处形成纤维软骨层[50-51]。该阶段巨噬细胞通过分泌一定水平的细胞因子(如IL-1、IL-10及NO等)诱导各类细胞的增殖分化，促进胶原纤维的有序排列，使修复组织的组成及结构进一步成熟[5，52]。有研究证明IL-1可通过活化谷氨酰胺转移酶促进软骨基质磷灰石沉积，从而促进软骨基质的钙化，该阶段骨长入和钙化的程度直接影响骨腱修复后的生物力学性能[53-54]。骨腱界面未钙化纤维软骨层及肌腱区血供较差，主要依赖骨髓腔内血管营养物质弥散透过钙化纤维软骨层的方式供给营养。有研究认为损伤早期VEGF的高表达有利于血管形成，为修复部位提供营养成分，促进骨腱愈合；但如果后期VEGF仍高表达，持续的血管再生可导致疼痛持续存在而被视为肌腱末端愈合不理想的表现[55]。此外，巨噬细胞代谢产生的NO水平对于骨腱界面的修复至关重要，适当水平的NO经一系列反应可使血管平滑肌舒张，保障损伤区域营养供应，同时抑制血小板聚集；但如果NO水平过高，则具有细胞毒性，可导致修复过程中软骨细胞的异常凋亡[56]。

3.1.4 最终的重塑期 重塑期骨腱界面巨噬细胞数量逐渐减少，微环境细胞因子水平趋于稳定。如果某些细胞因子仍高表达，如VEGF，往往预示着不良结局。纤维软骨层作为肌腱与骨的过渡区，可避免应力集中，起到缓冲作用[9]，而纤维软骨层作为骨腱界面的一种较为特殊的结构，由于血供较差，营养供应相对匮乏，该处的修复注定是一个缓慢而困难的过程，Leung等[57]在对兔髌骨与髌韧带连接点的研究中发现，重建术后24周，再生纤维软骨层的厚度仅为正常纤维软骨层厚度的十分之一。有研究表明，此阶段骨腱界面的愈合不再依赖于细胞的增殖，而更多地依赖生物力学刺激等手段来优化重塑期骨腱界面结构及功能的修复[58]。

3.2 纤维性骨腱界面

目前关于纤维性骨腱界面修复的研究不多，其修复过程也没有明确的分期。下面以自然状态下前交叉韧带重建术后的骨隧道环境为背景，对巨噬细胞在纤维性骨腱界面修复中的作用进行阐述[59]。

在肌腱植入骨隧道后的3～7 d，肌腱与隧道之间渗透着疏松的维管组织，周围环境以成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞浸润的炎症反应为特征。Hays等[60]在大鼠前交叉韧带损伤模型中，通过术前及术后静脉注射氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞，发现能够有效提高前交叉韧带重建术后早期骨腱界面的愈合质量，其中可能的机制是与巨噬细胞分泌的TGF-β减少有关。但是，另有研究证实巨噬细胞通过分泌TGF-β能够募集干细胞至损伤部位[46]，并调控干细胞的成骨分化能力[47]。所以，巨噬细胞在损伤后早期具体作用机制仍有待于进一步探索。

在术后1～2周，巨噬细胞分泌的各种细胞因子，如VEGF、成纤维细胞生长因子(FGF)和BMPs等，在促进界面成纤维细胞、骨细胞和软骨细胞分化等方面发挥着重要作用，使隧道内形成新生血管，在骨壁附近稀疏可见新形成的骨小梁[61-62]。

在手术后约4周，界面的维管组织变得密集且有序，且伴随Ⅱ型胶原沉积及软骨样细胞从骨移入肌腱移植物而逐渐发生退化。新形成的板层骨和早期的纤维软骨逐步成长为界面组织。由于新骨的形成，肌腱周围的骨壁变厚。然而，在这一阶段，胶原纤维仍然排列紊乱，肌腱和骨骼之间偶尔可见连接。破骨细胞作为终末分化的组织定居巨噬细胞在长骨的形成和修复过程中起着重要作用[63-64]。此时，骨隧道中骨腱界面的愈合依赖于骨的向内生长，而破骨细胞的过度活动可打破骨吸收与骨生成之间的平衡，扩宽隧道阻碍修复。Rodeo等[65]发现，给予抑制破骨细胞生成的骨保护素(osteoprotegerin，OPG)可促进隧道内新生骨形成，提高前交叉韧带重建的稳定性。

之后的第6周，胶原纤维变得更加成熟，肌腱和隧道骨骼之间重新建立起连接。在第8周时骨腱界面可见垂直排列的Sharpey纤维，这些纤维由Ⅲ型胶原蛋白构成，连接骨与肌腱移植物，被认为是肌腱与骨整合的最早征象[17，66]。类比正常的前交叉韧带附着部位，直接连接被认为是理想的愈合方式，但愈合方式和愈合时间仍受多种因素影响[59]，如骨腱界面修复在骨隧道内所承受的力学环境刺激有别于经典修复模式，骨隧道内骨腱界面承受着肌腱的非生理性剪切力，而经典修复模式下骨腱界面承受着肌腱的生理性拉伸力，这可能是产生差异性连接的众多原因之一[16]。

4 巨噬细胞相关治疗策略的总结及展望

目前，在其他领域疾病的治疗研究中，针对巨噬细胞开发的治疗策略相继出现。在以巨噬细胞为基础的治疗中，通过注射氧糖剥夺预处理后的M2样小胶质细胞，可促进脑梗塞恢复[67]；在以巨噬细胞代谢为基础的治疗中，Jing等[68]通过抑制Fcγ受体介导的巨噬细胞糖酵解过程，可有效减少肾巨噬细胞的激活及促炎因子的分泌，达到治疗狼疮性肾炎的目的[68]；在以巨噬细胞细胞器为基础的治疗中，Mills等[69]发现鱼藤酮通过线粒体解偶联和表达替代性氧化酶，可以阻止巨噬细胞线粒体活性氧的产生，保护小鼠免受LPS致死[69]；在以巨噬细胞lncRNA为基础的治疗中，Sun等[70]证实通过靶向巨噬细胞的microRNA-183-5p/ITGB1通路，抑制动脉粥样硬化进展相关的lncRNA-RAPIA，可抑制动脉粥样硬化的进展。

在骨腱界面修复过程中，巨噬细胞及其细胞因子出现的时空顺序及表达水平对骨腱界面的修复至关重要[71]。如何在体内诱导巨噬细胞定向分化，使其充分发挥促进修复的作用，避免不良结局，是巨噬细胞在骨腱界面损伤发挥临床疗效的关键环节。