黄缘闭壳龟死亡病例的感染病原探究

杜孟泽 ， 赵 颖 ， 贾永根 ， 黄亚东 ， 刘贤勇

(1. 中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 首都医科大学附属北京友谊医院 热带病防治北京市重点实验室 ， 北京 西城 100050 ； 3. 北京龟道生物科技有限公司 ， 北京 昌平 102208)

黄缘闭壳龟是中国境内的八大闭壳龟之一，被列入《人工繁育国家重点保护水生野生动物名录》，也是世界上被广泛饲养的一种观赏龟，具有很高的观赏价值[1]。我国龟类疾病研究相对缺乏，针对黄缘闭壳龟在人工养殖环境或天然野生环境中的疾病研究更是罕见。由于该品种人工养殖规模的不断扩大，产生的疾病诊疗问题随之而来。我国境内众多人工繁育的龟鳖品种中仅中华鳖(Trionyxsinensis)有相关病例报道。深圳地区出现过由虹彩病毒引起的以严重贫血为典型特征的鳖类疫情[2]； 后完成了该病毒的全基因组测序，证明其属于虹彩病毒科的蛙病毒属[3]。

2015年8月，北京某人工养殖场引入一批净重均约为12 g的黄缘闭壳龟。同年10—11月，饲养的黄缘闭壳龟曾发生一起群发性疾病，同等环境下养殖的12只龟中有6只幼年龟陆续出现过相同的症状(虚弱、消瘦、反应迟钝)，其中1只于2015年11月9日死亡。发病期间患龟曾口服磺胺甲噁唑进行治疗。治疗后，多数龟的症状有所减轻。为了探究幼龟的死亡原因，本试验采用了PCR扩增与二代测序相结合的方法，初步确定口龟杆菌(Chelonobacteroris)存在于感染的黄缘闭壳龟脏器内，并推测其与感染动物的死亡有密切关系。口龟杆菌是近年来新发现的龟类致病菌,其为巴氏杆菌科、龟杆菌属(Chelonobacter)的唯一种[4]，与其亲缘较近的龟巴氏杆菌(Pasteurellatestudinis)均可以引起龟的相关疾病[5]。

1 材料与方法

1.1 主要材料 DNA提取试剂盒EasyPure Genomic DNA Kit、DNA聚合酶FastPfu Fly DNA Polymerase、凝胶提取试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit、DNA分子量标准品Trans2K Plus DNA marker，均购自北京全式金生物技术有限公司。试验涉及的所有引物均由北京天一辉远有限公司合成。

1.2 死亡幼龟的病理学剖检与组织病理学观察 病理剖检顺序：移除腹甲暴露体腔，摘除心脏，清理胃和其他组织相连的网膜，并分离出肝脏；剪断食道、直肠及周围连接的组织，摘取游离的消化道与脾脏，再分离肺脏与肾脏；开颅获取脑部与部分脊髓。获得的脏器经观察记录后取疑似存在病变的部位浸于10%福尔马林中固定，组织样本经脱水透明后包埋于石蜡，切成3～5 μm的切片，按H.E.染色的常规步骤染色封片并于显微镜下观察。同时无菌操作下切取肝脏、脾脏、十二指肠的组织块，存于-80 ℃保存。

1.3 组织样品中潜在病原菌的PCR诊断与Illumina测序分析 16S rRNA和18S rRNA基因序列分别是细菌和真菌用来编码rRNA的基因序列，常用于鉴定病原微生物种类。使用DNA提取试剂盒在无菌操作下对肝脏、脾脏与十二指肠的DNA进行提取。来源肝脏与十二指肠的DNA经PCR检测其中可能所含的细菌16S rRNA基因序列。同时检测肝脏与脾脏的DNA提取物中的真菌18S rRNA基因序列。检测细菌与真菌所用的引物见表1。采用50 μL反应体系进行PCR扩增：ddH2O 22 μL，Primers (F/R，10 μmol/L)各1 μL， 2 ×TaqMix 25 μL，DNA模板1 μL。PCR程序：94 ℃预变形5 min；94 ℃变形1 min，56 ℃退火1 min， 72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。 1 μL 无菌ddH2O作为阴性对照。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测。肝脏与肠道的总DNA样本通过16S rRNA基因扩增后，使用Illumina Miseq PE300 测序平台进行二代测序。测序后得到的原始数据经过QIIME[8]与MOTHUR[9]软件处理后得到了高质量的序列。这些序列经过NCBI数据库比对后进行聚类分析，默认相似度大于97%的序列划归在同一个分类操作单元(Operational taxonomy units,OTUs)。

表1 PCR扩增引物Table 1 Primers used in amplification

2 结果

2.1 大体剖检与组织病理学切片观察 死亡病例剖检与病理学切片观察结果见图1。死亡动物小肠浆膜层可见大量出血点，十二指肠上有一贯穿孔，体腔内充满由此溢出的小肠内容物；肝脏上可见棕黄色斑点；肾脏体积增大。组织切片显示，十二指肠在低倍镜下可见较为清晰的黏膜层、黏膜下层、肌层与浆膜层等结构。肠腔中有较多粉染的纤维素样渗出并伴有多量的蓝染细胞渗出；黏膜层局部出现损伤，存在明显的肠上皮细胞脱落；黏膜下层中肠腺少，间质水肿，结缔组织疏松，血管充血明显，大量蓝染细胞浸润；粉染肌层肌纤维排列紧密有序；浆膜层完整。高倍镜下：黏膜下层尚存少量腺体，多层圆形蓝染透亮胞核，红染胞质的腺上皮细胞围成圆形至椭圆形的腺管，外有极薄的基底层包裹；结缔组织疏松水肿，间隙中可见多量粉染纤维样物质；充血出血明显，伴有大量淋巴样细胞浸润。肌层中肌纤维断面清晰，肌细胞胞核圆形至多边形，呈蓝色淡染。浆膜层完整，与肌层间距未见异常。肾脏切片在低倍镜下可见部分肾小管有水肿、小管上皮脱落的情况，肾间质中有明显的淤血。高倍镜下肾小囊与肾小管中均可见粉染的刷状物，肾间质中还可见大量的红细胞与异嗜性粒细胞。大脑实质中广泛分布大量淋巴样细胞，并在血管周围形成血管套结构，提示存在脑炎。

图1 死亡龟大体、组织病理学检测Fig. 1 Gross and histopathological detection of dead turtlesA:小肠浆膜层面； B：小肠穿孔； C：小肠(H.E.染色,40×)； D：肾脏(H.E.染色,100×)； E：大脑实质(H.E.染色,100×)； F：肝脏中的细菌菌落(H.E.染色,1 000×)A:Serosal layer of small intestine; B:Small intestinal perforation; C:Small intestine (H.E.staining,40×); D:Kidney (H.E.staining,100×); E:Brain parenchyma (H.E. staining,100×); F:Bacterial colonies in liver (H.E.staining,1 000×)

2.2 PCR与二代测序 PCR结果见图2。在肝脏和十二指肠中可以经PCR成功获得细菌的序列，且不能在肝脏与脾脏中扩增出真菌的序列。

图2 病原基因PCR扩增Fig.2 PCR amplification of pathogenic genes1：阳性对照； 2、3：死亡动物肝脏和十二指肠组织中16S rRNA基因的PCR扩增结果； 4：阴性对照； 5：阳性对照； 6、7：死亡动物肝脏和脾脏组织中18S rRNA基因的PCR扩增结果8:阴性对照1：Positive control； 2,3：PCR amplification of 16S rRNA gene from liver and duodenum of dead animals; 4: Negative control; 5:Positive control; 6,7: PCR amplification of 18S rRNA gene from liver and spleen tissues of dead animals; 8: Negative control

经细菌16S rRNA二代测序分析，肝脏与十二指肠中一共找到了55个分类单元(OTUs)的细菌。在肝脏中找到的OUTs均出现在十二指肠中。出现频率排在前10位的OUTs见表2。其中在肝脏组织中口龟杆菌最多，占全微生物数量的66.3%。而在肠道中口龟杆菌占全微生物数量的5.8%，居第3位。

表2 死亡病例肝脏与十二指肠中排名前10位的微生物Table 2 The top 10 OUTs in the liver and duodenum of dead turtles

3 讨论

通过病理剖检初步确定了十二指肠穿孔是引起本例黄缘闭壳龟幼龟死亡的直接原因。进一步的病理切片诊断表明，小肠尤其是穿孔部位出现了明显的水肿、血管充血、炎性细胞浸润等典型的由细菌感染引起的炎症反应。大脑实质弥散性分布炎性细胞，有显著的血管套形成，提示了继发性脑炎的可能。在肝脏和肾脏组织切片中，发现了黑色的菌团样结构。综上推测可能是细菌感染引起的肠道穿孔，并继发引起了其他器官的炎症反应。

为了进一步证实现有推测，本试验对肝脏DNA样品进行16S rRNA基因扩增，发现了阳性扩增条带。同时对18S rRNA基因也进行了扩增，结果为阴性。本试验也对现有龟鳖上最常见的2种病毒(虹彩病毒与疱疹病毒)进行了PCR鉴定，其结果均为阴性(数据未展示)。

为了进一步明确致病菌可能的种类以及其在发病器官的分布情况，本试验对十二指肠和肝脏样品的DNA进行了二代高通量测序。结果显示，肝脏中所含有的疑似致病菌数量最多的为口龟杆菌。其在十二指肠的含量仅次于肠道常见的大肠杆菌以及棒杆菌属[10-11]。据相关研究，口龟杆菌被认为可以导致陆龟的肠道疾病[4]，并且本菌所在的巴氏杆菌科的细菌大多数对家畜也都具有致病能力[12]。因此推测相比于大肠杆菌这类常见共生菌，口龟杆菌更有可能是引起本例黄缘闭壳龟死亡的致病菌。进一步研究口龟杆菌对黄缘闭壳龟甚至其他龟类的致病性则需要进一步建立合适的回归感染模型，确定其致病能力。