食品中产毒真菌核酸检测方法的研究进展

张庆, 赵晓美, 王娉, 刘冰, 陈颖*

(1.天津科技大学食品科学与工程学院, 食品营养与安全国家重点实验室, 省部共建食品营养与安全重点实验室, 天津 300457; 2.中国检验检疫科学研究院农产品安全研究中心, 北京 100176)

产毒真菌主要是指曲霉属(Aspergillusspp.)、青霉属(Penicilliumspp.)、镰刀菌属(Fusariumspp.)中能够产生复杂有毒次级代谢产物的真菌，如黄曲霉(Aspergillusflavus)、赭曲霉(Aspergillusochraceus)、展青霉(Penicillumexpansum)、镰刀菌属(Fusariumspp.)等。它们能够产生多种真菌毒素，如黄曲霉毒素(aflatoxin)B族和G族化合物具有强致癌、致畸作用，已被国际癌症研究机构(International Agency for Reasearch on Cancer，IARC)列入Group1分组(对人类是致癌物)；赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)会侵害肝肾等器官；展青霉素(patulin)则会引起组织和器官病变、侵害神经系统；玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)主要对生殖系统产生危害，导致不孕、流产等病症；T-2毒素是一种A型单端孢霉烯族化合物，具有免疫毒性，会抑制蛋白质合成。产毒真菌污染食品普遍发生在食品的加工、运输、贮藏环节，其代谢产生的毒素会随着食物进入人体，对健康造成很大威胁。目前国内外对于防控真菌污染食品的研究多是针对真菌毒素检测，采用的技术主要有色谱技术、色谱质谱联用技术、免疫分析技术和生物传感器技术等[1]，虽然可以有效实现对食品中真菌毒素的定性或定量分析，但是这种针对已被污染食品中的毒素含量检测难以挽回已造成的经济损失。

相较于真菌毒素的检测，直接对产毒真菌检测能够前置化干预其对食品的污染及对人类的危害，能够在产毒真菌污染食品早期未产生毒素前发现问题，以便于及时采取措施。食品中产毒真菌鉴定方法有形态学观察和生化鉴定[2]等，存在需要对真菌培养、实验周期较长、操作步骤繁琐、主观依赖性强、灵敏度低等缺陷。也有学者使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)对丝状真菌进行鉴定[3-4]，但是此技术依赖于完备的数据库，而种类复杂且多样化的真菌给数据库建立带来了非常大的挑战。因此，亟需一种快速、高通量的产毒真菌检测方法来保障食品真菌污染方面的质量与安全。

基于核酸的检测方法可以有效解决上述问题，不仅实现直接对产毒真菌的检测，也一定程度上解决了真菌鉴定需要培养的问题，弥补了传统技术在真菌检测中存在的缺陷，尤其是以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术为基础发展而来的各种检测方法。本文综述了近年来基于核酸检测方法在食品产毒真菌中的检测鉴定及应用，探讨了其优缺点，并展望了产毒真菌检测方法的未来发展趋势。

1 基于PCR技术的产毒真菌检测方法

1.1 常规PCR方法

PCR技术是1985年Mullis等[5]最先提出的一项DNA体外扩增专利技术，在产毒真菌检测方面的应用原理是根据已经公布的能实现分类鉴定的DNA序列设计引物，使用常规PCR技术扩增出目的基因后进行琼脂糖凝胶电泳，通过比对分析扩增的DNA片段实现真菌的检测鉴别，通常针对具有产毒能力真菌的检测会结合其已经公布的毒力基因。张健等[6]使用真菌鉴定通用引物ITS1和ITS4对72株曲霉属真菌进行分类鉴定，结合OTA合成相关的聚酮合酶(PKS)的AT域序列设计特异性引物，使用单重PCR技术完成对产OTA黑曲霉(Aspergillusniger)的检测，在基因组DNA浓度为12.5 pg·μL-1时可检测到，虽然该方法产生了4%的假阳性结果，但是仍然可以作为产毒性黑曲霉的有效检测方法。顾双等[7]提取11种市售食品总DNA，使用ITS序列的引物pITS1和pITS4对其进行真菌鉴定，结合橘霉素生物合成相关基因pksCT的引物K和L，同样使用单重PCR技术完成对食品中产橘霉素真菌的检测，并对发酵前、发酵中及灭菌后的pksCT基因扩增情况进行了评价，结果表明，食品加工过程中各条件参数会影响目的基因的检出率，红曲霉发酵食品能够扩增pksCT基因，而曲霉发酵食品未扩增pksCT基因。Gonzalez-Salgado等[8]采用曲霉rDNA的多拷贝内转录ITS区域引物ITS1和ITS4，结合单拷贝的黄曲霉毒素生物合成基因的特异性引物FLA1和FLA2，使用单重PCR技术实现对小麦粉中产黄曲霉毒素的黄曲霉及寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)的检测，结果表明，FLA1/FLA2的检测可以有效避免假阴性的产生，检出限(limit of detection，LOD)为10 pg·μL-1，但是该研究未能区分开黄曲霉和米曲霉(Aspergillusoryzae)。

以单重PCR技术为基础，多重PCR技术是在同一个反应体系中加入2对或2对以上的引物，实现单体系同时扩增多个片段，进一步缩短了检测时间，减少了工作量。李慧等[9]使用真菌鉴定通用引物ITS-600-F、ITS-600-R，结合依据国家标准中的aflR(产黄曲霉毒素调节基因，aflatoxin biosynthesis regulatory gene)、omt-1(柄曲霉素转甲氧基酶基因，sterigmatocystin o-mcthyltransferase gene)、ver-1(杂色曲霉素A脱氢酶基因，versicolorin A dehydrogenase gene)设计3对引物，在单体系中同时进行4对特异性引物的多重PCR反应，快速高效地完成对产黄曲毒素真菌的检测，在基因组DNA浓度为100 pg·μL-1时可被检出。Sadhasivam等[10]首先使用4～5组种特异性引物建立了可检测7个曲霉属、9个镰刀菌属和5个青霉属的5个多重PCR体系，然后使用根据真菌毒素生物合成相关基因设计的引物建立了检测产黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A及镰刀菌毒素真菌的3个多重PCR体系，其LOD也达到100 pg·μL-1，其多重PCR检测结果与LC/MS/MS检测真菌毒素结果之间具有很好的相关性。多个多重PCR联用可能成为快速筛选大量样本的可靠诊断手段，使真菌检测工作更加便捷高效。但是从以上研究可以看出，多重PCR方法的灵敏度相较于单重PCR均较低，这可能是由于不同引物的特异性不同，存在底物竞争现象会降低体系的灵敏度。

PCR技术的出现解决了传统方法中真菌检测需要经过培养的问题，缩短了检测所需时间，降低了检测限，使产毒真菌的检测技术从传统形态学观察及生化鉴定迈入了分子生物学技术的时代。常规PCR方法适用于扩增较长片段的真菌DNA，也是DNA指纹图谱方法及DNA条形码方法中的常用技术之一，但该方法不能对目标真菌实现定量检测。

1.2 实时荧光定量PCR方法

实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qPCR)最早是Higuchi等[11]于1993年提出的可以实现定量的PCR方法，完成PCR技术从定性到定量的革命性跨越。该技术的原理是将具有荧光标记的核苷酸序列或荧光染料加入到反应体系中进行PCR反应，采集这些荧光信号后通过绘制扩增曲线即可实现对PCR反应过程的实时检测，并且借助建立的标准曲线可以实现对未知样品的绝对定量或相对定量。

实时荧光定量PCR技术的出现不仅简化了实验操作流程，缩短PCR反应时间，闭管实验降低气溶胶污染的风险，而且提高了PCR反应的特异性和灵敏度。Mylroie等[12]对黄曲霉的rRNA基因间隔区(IGS)设计特异性引物，使用SYBR Green染料法的qPCR技术对人工混合的DNA样品进行定量，定量限(Limit of quantity，LOQ)为2.9 pg·μL-1，相较于普通PCR的LOD，其灵敏度有所提高且实现了定量检测。王香君等[13]使用真菌鉴定通用引物对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、青霉、曲霉进行了SYBR Green染料法的qPCR检测，通过对溶解曲线分析确定0817F/1196R为检测用引物，建立了单一真菌菌种DNA的标准曲线实现定量，3种真菌的LOQ约为6.5×10-3pg·μL-1，定量的灵敏度大大提高。Kulik[14]使用TaqMan探针法的单重qPCR方法对镰刀菌的3ADON、15ADON及NIV3种基因型的Tri12基因进行了检测，确定3种基因型的检出限分别为20、1、10 pg。

具有多个荧光通道的实时荧光PCR仪为多重qPCR的建立奠定了基础，通过设计合成含有不同荧光标记的TaqMan探针可以实现在单个反应体系中进行多个片段同时扩增的多重qPCR。金燕等[15]根据真菌rRNA基因序列设计ASPP、PENP、FUSP 3种特异性探针，将多重qPCR技术与裸磁珠富集技术联用建立了可对辣椒中曲霉属、青霉属和镰刀菌属3种产毒真菌的快速定量检测方法，LOD达到103CFU·g-1，包括DNA提取在内的检测时间缩短至7 h。多重qPCR的检出限有可能比单重qPCR低，会受反应体系使用的引物/探针等因素的影响。Vegi等[16]根据单端孢霉烯合酶基因(Tri5)、rRNA基因和聚酮化合物合酶基因(Pks)设计出了3组引物探针，使用多重qPCR技术开发了可同时对产真菌毒素的赭曲霉、疣状青霉(Penicilliumverrucosum)及禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)快速定量的方法，对基因组DNA的最低检测限达到3 pg，比Kulik[14]的检测方法检出限更低。

qPCR方法适用于扩增片段大小为100～300 bp的真菌DNA，并且既可以对真菌的基因组DNA进行定量，也可以对真菌菌体数量进行定量。其中，SYBR Green染料法定量较TaqMan探针法成本低，但是该方法存在与非特异扩增产物结合产生假阳性的问题，因此不能进行多重qPCR体系的建立。

2 基于DNA指纹图谱技术的产毒真菌检测方法

DNA指纹图谱技术是利用不同物种DNA水平上的多态性差异，以现代分子生物学方法标记并建立可以有效鉴定或检测物种图谱的技术[17]。目前，较为常见的DNA指纹图谱技术根据报道时间先后顺序主要包括限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、单链构象多态性(single strand conformation polymorphism，SSCP)、随机扩增多态性(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性(amplified dragment length polymorphism，AFLP)等。

2.1 RFLP方法

限制性片段长度多态性(RFLP)是Botstein等[18]于1980年提出的分子标记技术。其原理通常是使用合适的引物对特定区域扩增后，使用限制性内切酶酶切PCR产物并进行琼脂糖凝胶电泳分析，通过与已建立的PCR-RFLP图谱比对达到鉴定或检测的目的。随着基因测序技术的普及和发展，也会将电泳产物纯化后测序，结合序列同源性比对得到更加准确的结果。Bisbal等[19]通过对真菌ITS区域进行常规PCR扩增并使用限制性内切酶HhaⅠ、NlaⅢ和RsaⅠ对PCR产物酶切后电泳，将电泳图与4种ITS-RFLP图谱比对，结合测序结果的序列同源性比对完成对132株黑曲霉的分类学鉴定。王彩虹等[20]通过将RFLP指纹图谱技术与真菌ITS基因文库、测序和系统发育学分析相结合，对泸州老窖高温大曲和郎酒超高温大曲的真菌菌落结构进行了研究，通过使用通用引物ITS1和ITS4对真菌ITS序列扩增并通过MspⅠ和HhaⅠ进行双酶切构建酶切图谱，与测序得到的基因文库片段大小比对分析完成对真菌菌落结构的分析，此外通过ITS文库法还发现了Xeromycesbisporus、Thermomucorindicaeseuda-ticae、Trichomonascusciferrii等相关研究中未曾报道的菌种。Kizis等[21]也使用相同的真菌通用引物对真菌ITS序列进行常规PCR扩增，并使用HinfⅠ、HhaⅠ、RsaⅠ 3种限制性内切酶酶切11种不同的RFLP片段，将124个分离株划分为4个曲霉菌种，4个分离株划分为黑曲霉菌株。孙长坡等[22]通过对黄曲霉毒素合成途径调控基因aflR及其启动子序列设计引物并进行常规PCR扩增，使用NheⅠ、PvuⅡ、HincⅡ3种限制内切酶酶切PCR产物后电泳，结合测序结果进行多态性及RFLP分析，结果表明，对aflR启动子片段的NheⅠ位点分析可判别菌株的产黄曲霉毒素能力，对aflR基因的PvuⅡ和HincⅡ位点分析可以进一步实现黄曲霉和寄生曲霉的区分。根据ITS序列可以实现对产毒真菌的分类鉴别，根据毒力基因可以实现真菌产毒能力的评价，同时毒力基因也可能具有分类鉴别的功能；RFLP限制性内切酶需要根据真菌ITS序列或毒力基因的酶切位点来选择。

2.2 SSCP方法

单链构象多态性(SSCP)是Orita等[23]于1989年提出的一种单核苷酸链多态性分析技术，其原理是常规PCR扩增后的特定双链DNA片段经变性解旋后变成单链，变性后的单链核苷酸并不是保持一条直链，而是在氢键等分子作用力下形成具有一定空间三维构象的核苷酸链，导致单链核苷酸在电泳中具有不同的迁移速度，通过分析在电泳时由于单核苷酸差异所呈现的不同条带实现鉴定的目的[24-25]。陈娟等[26]采用基于β-tubulin基因片段的PCR-SSCP技术检测药材六神曲中含有3属5种真菌，但是基于β-tubulin基因设计的引物在扩增复杂DNA样品时存在扩增效率低的问题，导致该方法覆盖面较小。Susca等[27]对钙调蛋白基因种特异区域设计通用引物SSCPCL1和SSCPCL2，通过对50株曲霉属真菌进行PCR扩增，配合高灵敏度特性的毛细管电泳完成对黑曲霉的检测，使用SSCP技术准确鉴定出属于16个黑曲霉中的所有39个基因型，说明SSCP在结合高灵敏度的电泳时,其检测灵敏度也会大大提高。Dong等[28]使用真菌鉴定通用引物ITS4和ITS5扩增目的基因，通过PCR-SSCP技术结合低温时pH可变电泳基质的高分辨率特性完成从土壤中分离出尖孢镰刀菌的鉴定，并进行DNA测序、序列同源性比对验证了试验结果，同时该研究发现，双链DNA在变性过程中含有未完全变性的双链DNA，从而形成更加复杂的构象。

2.3 RAPD方法

随机扩增多态性(RAPD)是Williams等[29]和Welsh等[30]提出的一种通过分析随机引物经PCR扩增出的DNA片段多态性来鉴定物种或探索基因表达规律的技术。其原理是使用人工合成的多条随机寡核苷酸(10 nt左右)对基因组DNA进行常规PCR扩增，通过分析含有不同大小片段的随机PCR产物的电泳图，并与指纹图谱比对后达到鉴定或检测的目的[31]。Khodadadi等[32]通过随机扩增多态性DNA标记确定了产毒性和非产毒性黄曲霉与寄生曲霉之间的遗传关系，从开心果中分离出17株黄曲霉和34株寄生曲霉，通过高效液相色谱法测定了其产毒能力，并随机选择6株黄曲霉和13株寄生曲霉，使用5个随机引物进行PCR扩增，分析其多态性，结果表明，RAPD技术虽然无法鉴别产毒性能，但能够区分开黄曲霉与寄生曲霉。Fungaro等[33]使用10个随机引物扩增出95个RAPD位点，与指纹图谱对比，将25株菌株分为两组，结果显示，RAPD基因型与OTA的产生能力没有明显的相关性，在结合ITS区域测序结果与GenBank提供的数据建立了适应性更广泛的系统发育树后，不仅能够完成赭曲霉的检测，同时也研究了其产毒性能，为赭曲霉的检测工作奠定了理论基础。RAPD可以实现不同真菌的分类，但当利用条带强弱证明菌株之间差异时，很难比较和解释图谱。此外，某些产物可能代表扩增效率相对低的反应，技术因素的微小变动可能导致不同扩增反应中特定菌株产生的实际片段差异很大[34]。

2.4 AFLP方法

扩增片段长度多态性(AFLP)是Zabeau等[35]以专利的形式发明并发展出来的一种DNA多态性检测方法，其原理是根据基因组DNA碱基发生的插入、缺失、重复及酶切位点碱基突变等情况，对其进行双酶切产生随机大小的片段，通过设计AFLP的引物序列进行常规PCR扩增并进行变性聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)电泳，最后在胶块上会形成不同分子量大小、不同条带数指纹图谱，通过指纹图谱的比对实现鉴定或检测的目的[36]。AFLP技术是在RFLP技术基础上进行的优化与改进，提高了试验结果的可重复性和稳定性。Schmidt等[37]从食品中分离出70株真菌并进行了分类学及产毒能力鉴定，使用pre-EcoRⅠ primer、pre-MseⅠ primer、pre-BfaⅠ primer 3条AFLP引物对其基因组DNA进行了常规PCR扩增并对赭曲霉AFLP图谱进行聚类分析，结合基因测序技术对结果进行验证，最终建立了一套适用于赭曲霉鉴定的AFLP方法，相较于Kizis等[21]的黑曲霉鉴定的RFLP方法，其试验结果可重复性更好。Botton等[38]对两株炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius)进行RNA提取并反转录出双链cDNA，使用AFLP技术对双链cDNA酶切后进行常规PCR扩增，分析试验结果中119个OTA生物合成及调节的差异表达基因的PAGE条带指纹图谱，结合从电泳条带纯化出的DNA测序结果分析，为产OTA真菌的检测提供了一套方法，相较于Fungaro等[33]针对赭曲霉产毒性能的RAPD研究方法，其试验结果稳定性更好。

总之，不同DNA指纹图谱方法具有各自的优缺点，RFLP方法可以实现对产毒真菌的检测但灵敏度较低；SSCP方法适用于高通量食品样本的筛查，对DNA样品要求不高；RAPD方法不需要专门设计引物即可进行检测，适用于未知真菌序列的样品检测；AFLP方法相较于RFLP酶切的目的性更强，电泳分辨率更高，可用于构建真菌基因组高密度连锁图谱，适用于产毒真菌单一菌种的检测。但是，目前真菌DNA指纹图谱检测方法在产毒真菌检测中存在的问题是没有完整的指纹图谱库，不同实验室之间很难进行比较。

3 基于DNA条形码技术的产毒真菌检测方法

DNA条形码技术(DNA barcode)是Hebert等[39]于2003年提出的一种使用常规PCR技术及基因测序技术，利用短DNA片段进行物种鉴定或检测的技术。其中，短DNA片段通常是在物种中具有一定保守性的序列，比如线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(mitochondrial gene cytochrome coxidase I，COI)的特定DNA片段可以完成动物界中除刺胞动物门外的物种鉴定；叶绿体核糖激酶1，5-二磷酸羧化酶基因(ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase，rbcL)和蛋白成熟酶K基因(maturase K，matK)以及核基因片段(internal transcribed spacer，ITS)可完成植物界的物种鉴定[40-41]等。

DNA条形码技术在真菌鉴定时是将ITS确定为真菌的通用条形码[42]，配合其基因组其他DNA序列实现对真菌的分类学鉴定或者产毒性能检测[43]。DNA条形码在生物物种鉴定方面逐渐得到了广泛应用。如Geiser等[44]结合β-tubulin(微管蛋白基因)、CAL(钙调蛋白基因)实现对曲霉属的分类学鉴定；Seifert等[45]使用COI基因实现对青霉亚属的鉴定；Panelli等[46]扩增包括核糖体ITS1、ITS2和26SrRNA基因的D1/D2区域和非核糖体的β-tubulin、EF-1α基因的DNA条码，通过基因测序及序列比对，鉴定出了3株尖孢枝孢菌属(Cladosporiumoxysporum)的真菌及2株新菌种。Chen等[47]在Seifert研究的基础上研制了COX1条码寡核苷酸阵列，实现了对青霉亚属真菌的高通量检测，但是由于真菌种类复杂，其青霉亚属之间的COX1基因序列相似性很高，导致容易出现交叉反应，需要更多的实验来优化此检测方法。

DNA条码的选取是真菌分类鉴定的关键，由于目前在研究真菌的DNA条码时不能做到全部取样，仅用几个代表属种来验证此条码，具有一定的不合理性[48]。运用DNA条形码技术对真菌进行鉴别时，重点在于真菌种间和种内差异的界定，对于一些半知菌而言，无法明确其分类学地位，在应用该技术对半知菌进行鉴别时会有一定困难。随着DNA条码技术及真菌分类学的发展，对真菌种水平以下细分化的DNA条码也许会在实现真菌分类的同时,能预测其产毒性能。

4 展望

基于核酸的产毒真菌检测方法使用的技术虽然不同，但其原理相通，通常使用通用引物结合毒力基因或生化合成途径关键调控基因的特异性引物可实现对真菌分类及产毒性能鉴别。其中，真菌分类鉴定通用引物所选取的区域通常是多拷贝的核糖体DNA(rDNA)，包括18S小亚基单元、ITS1区、5.8S区、ITS2区和大亚基单元28S的序列[49]，并且不同产毒真菌可能携带相同或不同的毒力基因[50]。因此可以在毒力基因上提高检测的特异性，当对一种产毒真菌的多个毒力基因同时鉴别时，其鉴别特异性越强，检测结果越可靠。例如我国现行标准SN/T 2582—2010中对产黄曲霉毒素真菌的检测使用ITS序列引物结合黄曲霉毒素调节基因aflR、柄曲霉素转甲氧基酶基因omt-1、杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-13种基因，实现了对产黄曲霉毒素真菌的高特异性检测。

随着核酸技术的快速革新，其在食品中产毒真菌鉴定的应用上也发生着日新月异的变化，对真菌的鉴定也变得更加多元化。目前，核酸检测方法在产毒真菌方法检测中存在的技术难点是：在真菌污染食品的早期潜藏的菌体量非常少，需要对真菌进行富集，对核酸提取的方法要求高，否则达不到核酸检测方法的最低检测限，导致无法实现检测。数字PCR技术(digital PCR，dPCR)是[51]在常规PCR技术和qPCR技术的基础上发展起来的第三代PCR技术，其原理是通过一种技术方案将带有荧光探针的PCR反应体系稀释至单分子水平，并分配到几十至上千万个单元再进行常规PCR反应，最后通过对荧光单元进行读取计数分析计算，从而实现对样品拷贝数的绝对定量。数字PCR的技术方案主要分为微孔式、微腔式、微滴式等。其中，微滴式数字PCR技术(droplet digital PCR, ddPCR)以操作较简便、成本较低的优势得到了更广泛的应用[52]。ddPCR目前在微生物检测、肉制品掺假成分检测、产前诊断等领域取得了很大的进展，由于DNA被稀释成单分子并在单个反应室内进行，所以ddPCR具有很高的灵敏度并且可以降低复杂食品基质抑制因子的干扰，能够满足微生物快检的快速、高通量的要求，未来在产毒真菌快速检测中会有巨大的发展前景。