松果菊苷抑制博来霉素诱导的肺上皮细胞损伤及炎症反应*

崔艳红， 李克芳， 金 博， 彭 飞， 刘培培， 曲伟伟， 门 翔， 赵 江

（南阳市中心医院呼吸与危重症医学科二病区，河南南阳473000）

博来霉素（bleomycin，BLM）是一种抗肿瘤药物，主要用于淋巴瘤、鳞状细胞癌和睾丸肿瘤的治疗。而BLM 的临床应用常由于肺泡炎的发生而受到限制，且这种肺炎有可能发展为间质性肺纤维化［1］。在动物实验中，已观察到BLM 处理能导致肺组织中炎症细胞浸润，且肺组织中促炎因子、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和反应性含氮物质升高，甚至会导致肺纤维化的发生［2-3］。因此，抑制BLM 诱导的肺泡炎的发生对BLM化疗应用尤为关键。

松果菊苷（echinacoside，ECH）是从管花肉苁蓉中提取的一种苯乙醇苷类化合物。以往的研究［4-5］表明，ECH 对多种实体瘤细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用。近年来的研究［6-7］显示，ECH 还具有抗衰老、抗炎和抗氧化的药理作用。然而，目前ECH 对BLM 导致的肺上皮细胞损伤和炎症反应的作用尚未明确。因此，本研究采用体外细胞模型法，初步观察ECH 处理对BLM 刺激肺上皮细胞的凋亡、炎症因子水平和氧化应激的影响，并检测与氧化应激和炎症相关的蛋白核因子E2 相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2）、核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65 和环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表达水平。

材料和方法

1 实验材料

人Ⅱ型肺泡上皮细胞HEPApiC（上海佰晔生物科技中心细胞库）；胎牛血清（PAA）；DMEM 培养液（Gibco）；BLM 和ECH（北京迈瑞达科技有限公司）；Hoechst 33258 试剂、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒和CCK-8 试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）和 IL-1β ELISA 试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、ROS 和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；抗 Nrf-2、NF-κB p65 和COX-2 抗体（Stanta Cruz）；抗 GAPDH 和 Lamin B1 抗体及HRP 标记的Ⅱ抗（武汉博士德生物工程有限公司）。

2 方法

2.1 细胞培养 HEPApiC 细胞加入含10%胎牛血清的DMEM 培养液中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。当细胞约90%铺满时按1∶3 的比例传代，每3 d传代换液一次。取对数生长期的细胞用于后续实验。

2.2 CCK-8 实验筛选BLM 和ECH 的最佳处理浓度 将HEPApiC 细胞制成5×107/L 的细胞悬液，并接种100 μL细胞悬液于96孔板中，然后分别用0、1、2.5、5 和 10 mg/L 的 BLM 处理培养 48 h，然后根据试剂盒说明书，分别加入10 μL CCK-8 试剂，并在37 ℃下孵育2 h，用酶标仪检测450 nm 波长处的吸光度（A）值，以评估BLM 的最优实验浓度。然后，将细胞分别采用 0、5、25、125 和625 mg/L 的 ECH 处理 48 h，再次用CCK-8 法检测细胞活力，以筛选无细胞毒性的ECH 浓度范围。最后，将细胞用最佳浓度的BLM预处理30 min，再分别用筛选的无细胞毒性的浓度范围的ECH 分别处理48 h，再次用CCK-8 检测细胞活力，以筛选最佳的ECH实验浓度。

2.3 细胞分组 根据CCK-8 实验筛选的BLM 和ECH 浓度，分别将细胞分为空白对照（control）组、BLM 处理（BLM）组（最佳实验浓度的BLM 处理细胞48 h）和BLM+ECH 组（最佳实验浓度的BLM 预处理细胞30 min，再用最佳实验浓度的ECH处理48 h）。

2.4 Hoechst 33258 染色法观察细胞凋亡形态 分别收集各组细胞，在室温避光环境中用Hoechst 33258染色15 min，在显微镜下观察细胞凋亡形态。

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 用不含EDTA的胰酶消化各组细胞，1 207.4×g离心5 min，收集细胞，再用PBS重悬2遍，加入结合缓冲液后，转移至暗室，分别加入Annexin V-FITC 试剂和PI试剂混匀，并孵育15 min，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.6 ELISA 法检测各组细胞的 TNF-α、IL-6 和 IL-1β水平 收集已处理的各组细胞的培养基，置于冰盒上保存。然后根据ELISA 试剂盒步骤，先将各样品孔用各试剂盒中的抗体包被，然后在抗体包被的样品孔中加入10 μL 对应各组的培养基，再加入40 μL稀释液，封板膜封住反应孔，放入37 ℃水浴锅温浴30 min，弃去液体，洗涤液洗涤5 次，加 50 μL 酶标试剂，温浴30 min，洗涤5 次后，各孔加入显色液A、B各50 μL，37 ℃避光15 min；加入 50 μL 终止液，并在15 min内用酶标仪在450 nm 波长处测量各孔的吸光度（A）值。绘制标准曲线，计算各组TNF-α、IL-6 和IL-1β的含量变化。

2.7 试剂盒法检测各组细胞的氧化应激水平 分别按照试剂盒法检测各组MDA、ROS 和SOD 水平。对于MDA 含量的检测，先用RIPA 裂解各组细胞，并收集裂解液；然后用BCA 法检测裂解液中的蛋白浓度后，取各组裂解液与MDA 检测工作液混匀后沸水浴15 min，待冷却至室温后，536.6 ×g离心5 min，收集上清液，并分别取100 μL 上清液加入96 孔板，用酶标仪检测530 nm波长处吸光度值；最后，根据标准曲线计算各组样品上清液中MDA 含量，并用裂解液中单位质量蛋白的含量将细胞中MDA 的含量标准化。对于ROS 水平的检测，在37 ℃下，分别用10 μmol/L 的 DCFH-DA 避光孵育各组细胞 20 min，然后用荧光显微镜观察，并用自带软件统计各组荧光值。对于SOD 活性的检测，先用SOD 制备液充分裂解细胞，并在4 ℃下用190 000×g离心5 min收集上清液，并用BCA 法检测上清液中蛋白浓度；然后根据试剂盒提供方法分为样品孔、空白对照孔1 和空白对照孔2，并分别加入SOD 检测工作液和反应启动液，37 ℃孵育30 min，然后用酶标仪检测450 nm 波长处吸光度值；最后根据标准曲线和上清液中蛋白浓度计算SOD的活性。

2.8 Western blot 法检测蛋白的相对表达量 分别用细胞质/细胞核分离试剂盒和RIPA 萃取各组细胞的细胞质蛋白、细胞核蛋白和总蛋白。然后利用BCA 法将各组蛋白样品定量至相同浓度后，各组样品分别取 40 μg 蛋白进行 Western blot 电泳/电转程序。将电转后的蛋白用5%脱脂牛奶封闭后，室温孵育 1∶1 000 的稀释比例的Ⅰ抗（Nrf-2、NF-κB p65 和COX-2）2 h，TBST 洗涤 3 次后室温孵育相应的 HRP标记的Ⅱ抗1 h，TBST 洗涤3 次，加入显影液并进行显影；然后分别按上述方法孵育内参照。以Lamin B1 为细胞核蛋白内参照，以GAPDH 为细胞质蛋白和总蛋白内参照，用ImageJ 软件量化蛋白相对表达量。

3 统计学处理

结果均采用均数±标准差（mean±SD）表示，并采用SPSS 17. 0 统计软件进行统计学分析。采用单因素方差分析事后Bonferroni校正法进行多组间均数的两两比较。当P＜0.05 时，差异被认为具有统计学意义。

结 果

1 ECH能逆转BLM诱导的HEPApiC活性降低

图 1A 显 示 ，BLM 浓 度 为 5 和 10 mg/L 时 HEPApiC 活性显著降低（P＜0.05，P＜0.01），且在10 mg/L时细胞活性降低最为显著，故后续选择BLM 的实验浓度为10 mg/L。图1B显示，0～125 mg/L浓度范围的ECH 对 HEPApiC 无细胞毒性；且 25 和 125 mg/L 的ECH 均能部分抑制BLM 诱导的HEPApiC 活性降低（P＜0.05，P＜0.01），但ECH 在125 mg/L 时效果最为显著（图1C），故后续选择ECH 的实验浓度为125 mg/L。

2 ECH可减少BLM诱导的HEPApiC凋亡

Hoechst 33258 染色结果（图2A）显示，对照组细胞核正常，BLM 组HEPApiC 出现细胞核固缩和凋亡小体（荧光碎片）；BLM+ECH 组细胞的凋亡小体减少。流式细胞术检测结果（图2B、2C）显示，相较于对照组，BLM组细胞凋亡比例显著增加（P＜0.01）；给予ECH 后，由BLM 诱导的细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）。

3 ECH可降低BLM诱导的HEPApiC的炎症水平

图 3 显示，相较于对照组，BLM 组 HEPApiC 细胞的 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 分泌水平显著增加（P＜0.01）；给予 ECH 后，BLM 诱导的上述促炎因子的水平均显著降低（P＜0.01）。

4 ECH 可降低BLM 诱导的HEPApiC 的氧化应激水平

图 4 显示，相较于对照组，BLM 组 HEPApiC 细胞中ROS 和MDA 水平显著增加（P＜0.01），SOD 活性显著降低（P＜0.01）；与BLM 组比较，BLM+ECH 组HEPApiC 细胞中ROS 和MDA 水平显著降低（P＜0.01），SOD活性显著增加（P＜0.01）。

5 ECH 对 BLM 诱导的 Nrf-2/NF-κB/COX-2 信号通路的影响

Figure 1. Screening of BLM and ECH concentrations. A：effects of different concentrations of BLM on viability in HEPApiCs；B：effects of different concentrations of ECH on viability in HEPApiCs；C：effect of ECH on BLM-induced viability. Mean±SD.n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs BLM group.图1 BLM和ECH实验浓度的筛选

图 5 显示，相较于对照组，BLM 组 HEPApiC 细胞中细胞核 NF-κB p65、细胞核 Nrf-2 及 COX-2 蛋白的表达均显著增加（P＜0.01），细胞质NF-κB p65 和细胞质Nrf-2蛋白的表达显著降低（P＜0.01）；与BLM组比较，BLM+ECH 组 HEPApiC 细胞中细胞核 NF-κB p65、细胞质Nrf-2 以及COX-2 蛋白的表达均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），细胞质 NF-κB p65 和细胞核Nrf-2蛋白表达显著增加（P＜0.01）。

讨 论

BLM 是常用的抗肿瘤药物。然而，有研究［1-3，8］显示，BLM 在氧分子和铁离子存在下可产生活性氧自由基，活性氧不仅可引起急性损伤性肺泡炎，还可破坏肺泡上皮细胞中的DNA 空间结构，诱发脂质过氧化和细胞凋亡，损伤肺功能。因此，逆转BLM化疗造成的肺损伤对BLM 的化疗效果具有重大的意义。本研究采用BLM 刺激HEPApiC 以模拟体外环境BLM 诱导的肺泡炎，结果显示，ECH 能抑制 BLM 诱导的HEPApiC凋亡、促炎因子和氧化应激水平，提示ECH可能具有改善BLM诱导的肺泡炎的潜力。

Nrf-2 是细胞内维持氧化/还原平衡的主要转录因子，在正常生理状态下，其被限制在细胞质中且保持失活；在受到氧化刺激时，Nrf-2 易位到细胞核中，并与抗氧化剂反应元件结合而激活［9］。Nrf-2 激活可通过上调如SOD、血红素加氧酶1和谷胱甘肽还原酶等一系列抗氧化蛋白表达，从而减轻氧化应激引起的肺损伤［10-11］。本研究结果显示，在给予 BLM 作用后，HEPApiC 的氧化应激水平增加，且细胞中Nrf-2入核，而加入ECH 后氧化应激水平降低，且细胞中Nrf-2 入核进一步增加，提示ECH 降低BLM 诱导的HEPApiC 氧化应激可能与增强Nrf-2 核转位有关。在正常生理状态下，NF-κB 以非活性的形式被锚定在于细胞质内，在外界如氧化应激、感染和炎症等刺激下，NF-κB从细胞质转位于细胞核，激活NF-κB［12］。已有的研究［12-14］显示，降低NF-κB活性可抑制机体多种组织炎症。在本研究结果提示，ECH 减轻BLM 诱导的HEPApiC 炎症反应，可能与其降低NF-κB p65核转位有关。COX-2 是细胞炎症反应和凋亡的重要介导因子，在正常肺组织中几乎不表达COX-2；而肺组织受到氧化应激和致炎刺激时，COX-2 异常高表达，且高表达的COX-2 能加剧炎症反应和组织损伤［15-16］。在本研究中，COX-2 在 BLM 作用后上调，而加入ECH 后的COX-2 的表达明显降低，提示COX-2可能参与ECH 对BLM 诱导的HEPApiC 损伤和炎症反应的抑制作用。

Figure 2. ECH reduced BLM-induced apoptosis in HEPApiCs. A：Hoechst 33258 stained images（scale bar=20 μm）；B and C：apoptosis rate was detected by flow cytometry. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs BLM group.图2 ECH可减少BLM诱导的HEPApiC凋亡

Figure 3. ECH reduced BLM-induced inflammation level in HEPApiCs. The secretion levels of IL-6（A），IL-1β（B）and TNF-α（C）in HEPApiCs of each group were detected by ELISA. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs BLM group.图3 ECH可降低BLM诱导的HEPApiC的炎症水平

Figure 4. ECH reduced BLM-induced oxidative stress level in HEPApiCs. A and B：results of ROS level（scale bar=20 μm）；C：results of MDA level；D：results of SOD activity. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs BLM group.图4 ECH可降低BLM诱导的HEPApiC氧化应激水平

Figure 5. Effect of ECH on BLM-induced Nrf-2/NF-κB/COX-2 signaling pathway. A to C：the protein expression of NF-κB p65 in HEPApiCs was detected by Western blot；D to F：the protein expression of Nrf-2 in HEPApiCs was detected by Western blot；G and H：the protein expression of COX-2 in HEPApiCs was detected by Western blot. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs BLM group.图5 ECH对BLM诱导的Nrf-2/NF-κB/COX-2信号通路的影响

综上所述，本研究结果显示，ECH 对BLM 诱导的肺上皮细胞的氧化损伤和炎症反应具有抑制作用，且能促进Nrf-2 入核和下调NF-κB/COX-2 信号活性。但本研究尚存在一定的局限性，比如未进行动物模型的相关研究，也未对细胞进行恢复实验以验证ECH 对BLM 诱导的肺上皮细胞的氧化损伤和炎症反应的确切机制，故ECH 抗BLM 诱导的肺泡炎的具有作用及其具体机制仍需进一步研究。