重楼皂苷I对柯萨奇病毒B3诱导的病毒性心肌炎小鼠心肌的保护作用及其机制*

江振涛， 魏读辉， 马小峰， 李招兵

（南华大学附属南华医院心血管内科，湖南衡阳421002）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是一种前期由病毒感染引起的心肌局限性或弥漫性病变，可导致心肌损伤，影响心肌细胞能量代谢［1］。近年来VMC 的发病率呈现上升的趋势，感染的急性和慢性阶段均对患者构成致命威胁。目前VMC 的确切机制并不清楚且缺少特异的治疗药物，治疗方案常以减少心肌负担、改善心肌营养和消除炎症为主［2］。炎症反应的激活及炎性细胞的浸润在VMC 的心肌损伤过程中发挥着重要作用，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一种重要的核转录因子，其信号通路的激活能够诱导细胞因子、炎症介质等多种基因转录，参与炎症反应和细胞凋亡等病理生理过程［3-4］。既往研究表明［5-7］，VMC 模型小鼠的 NF-κB 信号通路被激活，而抑制其激活可减轻病毒感染导致的心肌损伤和心肌细胞凋亡。重楼为百合科重楼属植物根茎，主要化学成分为甾体皂苷。重楼皂苷I（polyphyllin I，PPI）是重楼中的主要活性成分［8］，大量研究表明PPI 可通过NF-κB 介导的炎症通路发挥抗炎作用［9-10］，但 PPI 对 VMC 的治疗作用及其作用机制鲜有研究报道。本研究拟采用柯萨奇病毒B3（coxsackievirus B3，CVB3）感染构建VMC 小鼠模型，探讨PPI在VMC 小鼠体内发挥的抗炎作用和具体调控机制，为PPI的研发和临床应用提供实验依据。

材料和方法

1 材料

1.1 实验动物 75 只雄性BALB/c 小鼠，无特定病原体（specefic pathogen free，SPF）级别，4～5 周龄，体重16～18 g，由南华大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证编号为SCXK（湘）2015-0002。饲养环境温度为22～25 ℃，相对湿度为45～65%，日光灯采光，12 h明暗交替。

1.2 主要药物及试剂 PPI（纯度≥98%）购自上海纯优生物科技有限公司；利巴韦林片购自江西汇仁药业有限公司；CVB3 嗜心肌Nancy 标准株购自美国标准菌种保存中心；BCA（bicinchonininc acid）蛋白浓度测定试剂盒和苏木素伊红（hematoxylineosin，HE）染色试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；白细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、心肌肌钙蛋白 I（cardiac troponin I，cTnI）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）和肌红蛋白（myoglobin，Mb）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、IκBα、p-IκBα（Ser32）、NF-κB、p-NF-κB（Ser536）和GAPDH抗体购于Abcam。

2 方法

2.1 动物造模与实验分组 75 只BALB/c 小鼠随机分成正常对照（control）组、VMC 模型（VMC）组、阳性药物利巴韦林（RBV，0.02 g·kg-1·d-1）组、重楼皂苷Ⅰ低剂量（L-PPI，75 mg·kg-1·d-1）组和重楼皂苷Ⅰ高剂量（H-PPI，300 mg·kg-1·d-1）组，每组 15 只。采用腹腔注射 0.15 mL 1×10-8TCID50/mL CVB3 病毒液建立病毒性心肌炎小鼠模型［11］。造模后2 h 通过腹腔注射给药，给药体积0.25 mL，每天1 次，连续给药1周，其中对照组和模型组注射等量生理盐水。

2.2 HE 染色观察心肌损伤情况 收集各组小鼠心肌组织，生理盐水漂洗后置于4%多聚甲醛中固定24 h，乙醇逐级脱水后石蜡包埋，切成5 μm 的薄片。按照HE染色试剂盒说明书对切片进行染色，于显微镜下观察心肌组织病理变化。随机在每张切片上取5 个视野，计算每个视野区域炎症细胞浸润、坏死的面积占整个视野面积的百分比，0 分：无病变；1 分：≤25%；2分：25～50%；3分：50～75%；4分：＞75%。

2.3 ELISA 法检测心肌损伤标志物和炎症因子含量 收集各组小鼠血清和心肌组织，心肌组织剪碎后匀浆离心，收集上清液，按照ELISA 试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪在450 nm 波长处测定各孔的吸光度（A）值，根据标准曲线计算血清中心肌损伤标志物 cTnI、CK-MB 和 Mb 及心肌组织中 IL-6、TNF-α和IL-1β含量。

2.4 RT-qPCR 检测CVB3 mRNA 表达量 取各组小鼠心肌组织，采用Trizol 法提取各样本的总RNA 并测定总RNA 浓度和纯度。取2 μg 总RNA 采用逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA 为模板进行RT-qPCR扩增。CVB3 正向引物序列为5’-CGGTACCTTTGTGCGCCTGT-3’，反向引物序列为 5’-CAGGCCGCCAACGCAGCC-3’；GAPDH 正向引物序列为5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，反向引物序列为5’-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3’。反应条件为 95 ℃预变性60 s；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共 40 个循环。以 GAPDH 为内参照，采用 2-△△Ct法计算CVB3 mRNA相对表达量。

2.5 Western blot 检测心肌组织中相关蛋白表达水平 取各组小鼠心肌组织，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液进行裂解提取总蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度，取30 μg总蛋白上样进行SDS-PAGE，电转至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），5%脱脂奶粉溶液室温封闭3 h，后加入相应的I 抗稀释液［cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、IκBα、p-IκBα（Ser32）、NF-κB、p-NF-κB（Ser536）和 GAPDH，1：1 000］，4 ℃过夜孵育，次日以TBST 洗涤后加入相应的辣根酶标记的II 抗，室温孵育1 h，充分洗涤后加入ECL 发光液于凝胶成像仪进行曝光拍照，利用ImageJ 图像分析软件进行分析，以目的条带与GAPDH 的灰度值比值作为目的蛋白表达的相对水平。

3 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示。正态分布数据组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 各组小鼠心肌组织损伤情况

如图1 所示，control 组小鼠心肌纤维排列整齐，心肌细胞结构正常，间质未见炎症细胞浸润；VMC组和L-PPI组小鼠心肌细胞排列紊乱，有明显的出血和水肿现象，伴有大量炎症细胞浸润；H-PPI 和RBV 组小鼠心肌细胞排列趋于规则，组织中炎症细胞减少，病理损伤程度显著减轻。Control 组、VMC 组、RBV组、L-PPI 组和H-PPI 组小鼠心肌组织病理损伤评分分 别 为 0、3.56±0.33、1.44±0.12、3.32±0.20 和1.67±0.16。与control组比较，VMC组小鼠心肌组织病理损伤评分显著增加（P＜0.01）；与VMC 组比较，H-PPI 和RBV 组小鼠心肌组织病理损伤评分显著降低（P＜0.01），L-PPI组无显著变化（P＞0.05）。

Figure 1. Histopathological observation of myocardium in each group（HE staining，scare bar=100 μm）. A：control group；B：VMC group；C：RBV group；D：L-PPI group；E：H-PPI group.图1 各组小鼠心肌组织病理学观察

2 各组小鼠心肌组织中CVB3 mRNA表达水平

control 组、VMC 组、RBV 组、L-PPI 组和 H-PPI 组小鼠心肌组织中CVB3 mRNA 相对表达量分别为0、14.07±0.12、2.75±0.06、6.89±0.11 和 13.47±0.10。与control 组比较，VMC 组小鼠心肌组织中CVB3 mRNA 表达量显著增加（P＜0.01）；与VMC 组比较，H-PPI 和RBV 组小鼠心肌组织中CVB3 mRNA 表达量显著减少（P＜0.01），而L-PPI 组CVB3 mRNA 表达量无显著变化（P＞0.05）。

3 各组小鼠血清中心肌损伤标志物含量

如表 1 所示，与 control 组比较，VMC 组小鼠血清中 cTnI、CK-MB 和 Mb 含量显著增加（P＜0.01）；与VMC 组比较，H-PPI 和 RBV 组小鼠血清中 cTnI、CKMB和Mb含量显著减少（P＜0.01），L-PPI组无显著变化（P＞0.05）。

表1 各组小鼠血清中cTnI、CK-MB和Mb含量比较Table 1. Comparison of the serum levels of cTnI，CK-MB and Mb in each group（Mean±SD. n=15）

4 各组小鼠心肌组织中炎症因子含量

如表 2 所示，与 control 组比较，VMC 组小鼠心肌组织中 IL-6、TNF-α 和 IL-1β 含量显著增加（P＜0.01）；与 VMC 组比较，H-PPI 和 RBV 组小鼠心肌组织中IL-6、TNF-α 和IL-1β 含量显著减少（P＜0.01），L-PPI组无显著变化（P＞0.05）。

表2 各组小鼠心肌组织中IL-6、TNF-α和IL-1β含量比较Table 2. Comparison of the contents of IL-6，TNF-α and IL-1β in myocardium of each group（ng/L. Mean±SD. n=10）

5 各组小鼠心肌组织中凋亡相关蛋白表达水平

如图 2 和表 3 所示，与 control 组比较，VMC 组小鼠心肌组织中凋亡蛋白cleaved caspase-3和Bax表达水平均显著上升（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著降低（P＜0.01）；与VMC组比较，H-PPI和RBV组小鼠心肌组织中凋亡蛋白cleaved caspase-3 和Bax表达水平显著下降（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著增加（P＜0.01），L-PPI 组无显著变化（P＞0.05）。

Figure 2. The protein levels of cleaved caspase-3，Bax，Bcl-2 in myocardial tissue detected by Western blot.图2 Western blot 检测心肌组织中cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达

表3 各组小鼠心肌组织中cleaved caspase-3、Bax 和Bcl-2蛋白表达水平比较Table 3. Comparison of the protein expression levels of cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 in myocardium（Mean±SD.n=10）

6 各组小鼠心肌组织中NF-κB 信号通路相关蛋白表达水平

如图 3 和表 4 所示，与 control 组比较，VMC 组小鼠心肌组织中p-IκBα（Ser32）和p-NF-κB（Ser536）蛋白表达水平显著上升（P＜0.01）；与VMC 组比较，HPPI 和 RBV 组小鼠心肌组织中 p-IκBα（Ser32）和 p-NF-κB（Ser536）蛋白表达水平显著下降（P＜0.01），LPPI组无显著变化（P＞0.05）。

表4 各组小鼠心肌组织中p-IκBα（Ser32）和p-NF-κB（Ser536）蛋白表达水平比较Table 4. Comparison of the protein expression levels of p-IκBα（Ser32）and p-NF-κB（Ser536）in myocardium（Mean±SD. n=10）

Figure 3. The protein levels of p-IκBα（Ser32）and p-NF-κB（Ser536）in myocardial tissue detected by Western blot.图3 Western blot 检测心肌组织中 p-IκBα（Ser32）和 p-NF-κB（Ser536）蛋白表达

讨 论

目前临床上治疗VMC 的主要方法有辅助支持疗法、免疫疗法和抗病毒治疗法，但治疗效果并不理想。VMC 的发病机制虽然十分复杂，但已有研究显示炎症反应为心肌炎心肌损伤的机制之一［12-13］。研究显示［14］，许多天然产物在改善心肌损伤及减轻炎症反应方面具有积极的作用。PPI 是从中药重楼中提取的甾体皂苷，可通过NF-κB 介导的炎症通路发挥抗炎作用［9-10］，但其对VMC的治疗作用及其作用机制鲜见报道。本研究结果显示，PPI 能够显著减少VMC 小鼠心肌组织内炎症细胞浸润，下调心肌组织炎症因子含量，抑制心肌组织细胞凋亡，其机制可能是通过抑制NF-κB信号通路的激活来实现的。

VMC过程中典型的病理变化是心肌组织出现弥散性坏死和炎症细胞浸润，同时由于病毒入侵导致心肌细胞的结构被破坏，细胞通透性增强，细胞内产生的酶类进入血液循环中，CK-MB、Mb 和cTnI 是心肌损伤特异性标志物，当心肌出现损伤时其在血液中的含量会迅速增加［15-16］。本研究结果显示，VMC小鼠心肌组织结构破坏，出血和水肿现象明显，伴有大量炎症细胞浸润，血清中CK-MB、Mb 和cTnI 含量显著增加，与前人研究一致［17-18］，说明 CVB3 诱导的VMC 小鼠模型构建成功。PPI 高剂量组小鼠心肌细胞排列趋于规则，炎症细胞浸润范围局限，坏死区域小，同时血清中CK-MB、Mb和cTnI含量明显下降，提示PPI能缓解CVB3诱导的小鼠心肌损伤。

机体免疫功能紊乱是VMC 的重要特征，炎症是机体抵抗病原入侵、修复组织细胞损伤的重要防御机制，若炎症反应持续维持在较高水平则会对细胞造成损伤［19］。IL-6、TNF-α 和 IL-1β 是 VMC 心肌损伤中重要的细胞因子，病毒感染心肌后其表达水平增加，促进炎性细胞浸润心肌组织从而加重心肌细胞损伤，诱导心肌细胞的凋亡［20］。本研究结果显示，VMC 小鼠心肌组织中 IL-6、TNF-α 和 IL-1β 含量显著增加，凋亡蛋白cleaved caspase-3 和Bax 表达水平增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表达水平降低，与魏傲等［21］研究一致。而PPI 高剂量组小鼠心肌组织中炎症因子含量和凋亡蛋白表达水平均明显回落，说明PPI能抑制VMC 小鼠心肌组织炎症反应，减少心肌组织细胞凋亡。

为了进一步阐明PPI 在VMC 小鼠体内发挥抗炎作用的具体机制，本研究通过检测炎症相关通路蛋白磷酸化水平来探究PPI发挥抗炎作用的主要靶点。既往研究表明［5-7］，NF-κB 炎症通路参与了 VMC 的发生发展过程：当细胞感染病毒后，NF-κB 与其抑制蛋白IκBα 解离后激活转入细胞核，诱导趋化因子、细胞因子、炎症介质等多种基因转录，参与炎症反应、免疫反应及细胞凋亡等病理生理过程。本研究结果显示，VMC 小鼠心肌组织中p-IκBα（Ser32）和p-NF-κB（Ser536）蛋白表达水平明显增加，PPI高剂量组小鼠心肌组织中p-IκBα（Ser32）和p-NF-κB（Ser536）蛋白表达被显著抑制，表明PPI可通过抑制NF-κB通路改善VMC小鼠体内的炎症反应。

综上所述，PPI可通过抑制NF-κB 信号通路的转导，减少心肌组织内炎症细胞浸润、下调炎症因子表达，降低心肌组织细胞凋亡，进而起到保护VMC 小鼠心肌组织的作用。