串联质谱技术在新生儿遗传代谢病筛查诊治中的应用分析

王庆华

（菏泽市妇幼保健院，山东 菏泽274000）

遗传代谢病(inherited metabolic diseases,IMD)是由于遗传物质发生改变，导致体内产生异常生化代谢物的一大类疾病，大多数为常染色体隐性遗传病，临床表现复杂多样，缺乏特异性，极易漏诊或误诊[1]。新生儿遗传代谢病筛查是指在新生儿群体中，用快捷、简便、敏感的检验方法，对危害儿童生命、导致儿童体格及智能发育障碍的先天性、遗传性疾病进行筛查，早期诊断、干预治疗，避免患儿机体各器官受到不可逆损害[2]。串联质谱技术（tandem mass spectrometry,MS/MS）能一次检测出数十种氨基酸、有机酸、脂肪酸代谢异常，为新生儿IMD的筛查提供了技术支持[1]。2015年5月—2020年12月，菏泽市新生儿疾病筛查中心利用串联质谱技术筛查266 609名新生儿，确诊各类遗传代谢病236例，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象2015年5月1日—2020年12月31日,利用串联质谱技术筛查菏泽市各医院出生的266609例新生儿，均为出生2～20 d，并充分哺乳的新生儿。

1.2 方法

1.2.1血液样本：根据《新生儿遗传代谢病筛查血片采集技术规范》，选择新生儿足跟内、外侧缘，按摩采血部位，用75%酒精棉签轻轻消毒采血部位并拭干，针刺采血部位，无菌棉签拭去第一滴血，单面轻压滤纸，血液自然浸透滤纸，连续采集3～4个8 mm直径大小的血斑，以水平位无污染、悬挂自然晾干，制成干血滤纸片，2～8℃冷藏保存，通过新生儿疾病筛查中心专用冷链递送渠道，5个工作日内递送至筛查中心筛查实验室。

1.2.2仪器、材料及试剂 仪器：API3200MD三重四极杆串联质谱仪(美国ABSCIEX公司)、液氮罐、振荡器、干血滤纸片手动打孔器、96孔板氮吹仪、96孔板离心机、移液器、电脑及打印机等仪器。材料：96孔聚丙烯板、96孔过滤板、干血滤纸片质控血片。试剂及配置：同位素内标试剂盒（试剂盒常分为2套：A套试剂盒含多种氨基酸同位素内标，B套试剂盒含游离肉碱及酰基肉碱的同位素内标），甲醇及乙腈溶液。配置内标母液：分别将装有氨基酸和酰基肉碱同位素内标粉溶于甲醇溶液，彻底混匀制成内标母液，取内标母液用甲醇稀释100倍制成内标工作液。配置流动相：用超纯水和色谱纯乙腈混匀，配成80%乙腈溶液[2]。

1.2.3样本的检测流程 采用非衍生化法，取下直径3 mm干血斑滤纸片，置于96孔过滤板中，加入同位素内标工作液，密封后置于振荡器约45 min，液体离心移至96孔聚丙烯板中，铝膜覆盖，置入串联质谱仪进样系统，样本中的目标物质随着流动相导入液相色谱分离系统，经过色谱柱、柱温箱分离后进入质谱真空系统，再经过质谱离子源,液体被雾化、离子化后，质谱质量分析器将离子碎片按质荷比分开，并按质荷比大小先后进入质谱检测器产生相应的信号得到质谱图[3]。

1.2.4疾病诊断 根据不同遗传代谢病发病机制所导致的血中特异性氨基酸或酰基肉碱的异常增高或降低，通过分析检测出的氨基酸、酰基肉碱的浓度及比值的高低，结合尿气相色谱-质谱分析仪（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）［3］检测结果，以及辅助检测血常规、血糖、血氨、甲胎蛋白、肝功能、心肌酶谱和/或基因测序等，可诊断新生儿患有某种相应的IMD。MS/MS检测结果高度疑似某种IMD者即刻召回进一步确诊检查，并结合临床表现开始干预治疗；对疑似阳性病例，进行再次复筛检查。

2 结果

筛查、确诊各类IMD共14种236例，氨基酸类疾病5种：高苯丙氨酸血症（HPA）74例，希特林蛋白缺乏症（CD）11例，酪氨酸血症3例，同型半胱氨酸血症（HCY）2例，枫糖尿病（MSUD）1例；有机酸血症4种：甲基丙二酸血症（MMA）106例，3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（MCCD）12例，异戊酸血症（IVA）和戊二酸血症-Ⅰ型（GA-Ⅰ）各1例；脂肪酸氧化障碍性疾病5种：原发性肉碱缺乏症（PCD）17例，短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症（SCAD）、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症（MCAD）、极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症（VLCAD）各2例，多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏症（MADD）2例。

3 讨论

IMD是由于细胞内遗传物质的异常突变导致的有异常生化代谢标志物的一大类先天性疾病，主要有氨基酸、有机酸、脂肪酸等代谢紊乱性疾病。由于代谢缺陷种类、受累脏器、疾病进展程度、生活环境、诊断早晚的不同，患者临床症状各异，病情轻重缓急不等，发病年龄早至胎儿，晚至成年，可致单个脏器或多个脏器损伤，致残致死率极高，严重危害患者生存质量。随着IMD诊断技术及早期筛查技术的发展，人们对IMD的了解越来越多，IMD从不治之症已成为可防可治之病，治疗效果也越来越好，关键是早诊断、早治疗、早干预，比如对PKU的早发现、早治疗就是很好的范例[1]。

我国新生儿疾病筛查始于1981年，已有40年的历史，筛查技术由最初的细菌抑制法、酶联免疫法、荧光法、时间分辨荧光免疫法，发展至今日的串联质谱技术检测法，筛查效率也由一次实验检测一种疾病发展为今日的一次实验可检测数十种疾病，实现了短时间内高效检测有异常生化代谢标志物的IMD，使新生儿疾病筛查有了飞跃的发展。串联质谱技术可以检测出代谢物水平异常。

本研究共筛查266 609名新生儿，确诊236例IMD，与欧美资料统计遗传代谢病在活产婴儿中总体发病率相近[2],明显高于国外的发病率，更远远高于国内新生儿IMD的发病率［4-8］。其中确诊MMA 106例，其发病率约为1/2515，远远超出上海新华医院报道的3/10万的患病率[1]，为最高单病种发病率。106例MMA中合并型MMA 100例（其中，因患儿出生时即发病且家长治疗依从性差，死亡3例；其余97例中包括继发性MMA 22例），单纯型MMA 6例，MCCD 12例。HPA共74例，HPA发病率为1/3603，其中苯丙氨酸羟化酶（PHA）缺乏71例；四氢生物蝶呤（BH4）缺乏3例。HPA为本地区发病率最高的氨基酸代谢性疾病，其次为CD，共11例，发病率为1/24237，远远高于上海新华医院新生儿疾病筛查中心报道1：83000[1]。PCD有17例，为脂肪酸氧化障碍性疾病中常见病，发病率为1/15693。另有TYR、SCAD各3例，HCY、MCAD、VLCAD各2例，MSUD（死亡）、GA-Ⅰ（死亡）、MADD/GA-II（死亡）、IVA各1例，其发病率与国内报道基本相符。

有些疾病在患儿出生1周内就有代谢物水平异常和/或临床表现，有些患者要在婴儿、儿童、甚至成人期相关氨基酸或酰基肉碱才出现异常，有些患者只在发作期生化指标异常较明显，而非发作期或无症状期可能不明显。因此，新生儿早期串联质谱筛查结果正常，并不能完全排除患病的可能[2]。对于迟发或症状不典型患者，常规治疗无效果时，临床医师根据临床表现要首先考虑MS/MS检测，以尽早确诊或排除IMD，避免致残致死的情况发生。同时，对经过筛查确诊的IMD患儿应制定严格的管理随访制度，对发病早、病情危重的患儿，通常采取边检查确诊边治疗干预，以减轻因病而造成的损害；对尚未发病或者症状轻微者，也尽早给予干预治疗，避免或减少代谢异常产生毒性物质的蓄积，从而避免或减轻IMD患儿不可逆的损害。经治疗病情稳定者，定期随访检测MS/MS、GC-MS，并进行生长发育评估等，不断改善IMD患儿预后。同时对IMD高危家庭进行健康教育，开展产前诊断，预防IMD患儿出生。

综上所述，应用MS/MS筛查新生儿IMD具有高特异性、高敏性和高效性，为新生儿IMD的筛查和诊治提供了可靠的技术支持。