外泌体在肿瘤转移和耐药相关研究中的进展

魏欣宇 王文锐 杨清玲 陈昌杰

外泌体（exosome）是一种具有脂质双分子层的盘状分泌膜泡，其直径在30～100 nm 之间。外泌体来自各种类型的细胞，包括癌细胞，间充质干细胞和多泡小体的免疫细胞［1］，故外泌体可从各种体液中分离出来，包括血液，尿液，唾液，母乳，羊水，腹水，脑脊液，胆汁和精液等。外泌体通过内向膜出芽经历三个过程产生：细胞膜内陷，形成内体（endosome）；内体膜内陷，形成多泡体（multivesicular bodies，MVB）；多泡体与质膜融合后分泌到胞外成为外泌体［2］。外泌体在受体细胞中的MVB 处进行反向融合，随后释放其携带的重要信号分子，在细胞间实现信息的传递［3］，形成一种新的细胞-外泌体-细胞的信息传递模式，介导体内不同类型细胞之间的细胞间通讯。这些信号分子包含外泌体同源母细胞代谢物、蛋白质、脂类和丰富的核酸分子（mRNA、tRNA、lncRNA、circRNA、microRNA 等）以及外泌体中特定细胞成分的功能性，靶向性，机制驱动性积累［4］。

1 外泌体在疾病进程中的作用

外泌体可参与细胞增殖、分化、血管生成和伤口愈合等许多生物学过程，也可通过癌基因或者肿瘤抑制因子在肿瘤细胞间的传递促进肿瘤的发生或抵消肿瘤的进展。已有许多研究证明在改善心功能和减轻心肌纤维化等方面，干细胞释放的外泌体显示出其潜在的细胞治疗和心脏修复能力［5］。另外，外泌体促进血管生成，但在炎症条件下，单核细胞衍生的外泌体可诱导血管平滑肌细胞的凋亡，这是人类血管疾病的重要发生过程。外泌体还可调节基因表达和驱动免疫抑制或免疫刺激反应等多种生物学过程，如肿瘤细胞来源的外泌体可通过同时诱导人肿瘤细胞和细胞毒性T淋巴细胞的凋亡来实现免疫逃避。在代谢性疾病中，肿瘤来源的外泌体作用于小鼠和人的脂肪细胞和肌肉细胞而加重机体恶病质，促进肿瘤及其他慢性疾病的进展［6］。

2 外泌体在肿瘤微环境中的作用和机制

肿瘤微环境（TME）是肿瘤的发生、生长及转移与肿瘤细胞所处的内外环境，其组成成分包含肿瘤相关成纤维细胞（CAF）、内皮细胞、免疫和炎症细胞、骨髓源性细胞以及与肿瘤建立复杂交叉关系的细胞外基质［7］。外泌体是肿瘤微环境中的重要组成部分。肿瘤来源外泌体包含的肿瘤抗原和热休克蛋白刺激免疫反应，包含的抑制分子配体如Fas-L、转化生长因子β（TGF-β）和前列腺素E2（PGE2）既可降低细胞毒性又能建立免疫抑制肿瘤微环境［8］。肿瘤来源的外泌体miRNA 在TME 中诱导基质重编程，创造有利于肿瘤生长、转移、免疫逃逸和化疗耐药的微环境［9］。在前列腺癌中，外泌体中携带的物质促进前列腺癌相关细胞的结缔组织增生，促进肿瘤转移［10］。

2.1 外泌体在肿瘤转移中所起的作用和相应机制

肿瘤转移是癌症相关死亡的主要原因，许多研究已经确定了外泌体在肿瘤转移中的直接侵袭作用和通过促进转移，转化和建立转移前利基的特定效应促进转移的作用［11］。肿瘤细胞来源的外泌体具有将转移潜能转移至受体细胞的能力，可为特定器官的细胞提供肿瘤转移前微环境［12］。Chen［13］等从唾液腺腺样囊性癌（SACC）患者血浆中分离出的外泌体中高表达lncRNA MRPL23 反义RNA 1（MRPL23-AS1），其与肺转移和总体生存相关。MRPL23-AS1 以“外泌体分泌”方式作用于肺微血管内皮细胞，增加了微血管的通透性，协助体内SACC 癌细胞的肺转移。用脑转移细胞分泌的外泌体预处理脑微环境可以增强癌细胞的生长。脑转移患者的肿瘤组织和外泌体中CEMIP 升高，CEMIP+外泌体被脑内皮细胞和小神经胶质细胞摄取后上调Ptgs2，Tnf 和Ccl/Cxcl 编码的促炎性细胞因子，诱导血管周围小生境中的内皮细胞和炎症，促进脑血管重塑和转移［14］。在引发转移的结肠癌亚型中，上调的circLONP2 调节miR-17 的细胞内成熟，上调的成熟miR-7 以外泌体的形式被邻近细胞内化而引起转移起始能力在原发部位扩散并加速异种器官肿瘤转移的形成［15］。另外，最近的研究［16］表明，对放化疗杀伤的垂死肿瘤细胞分泌的大量外泌体进行RNA-Seq 检测发现明显变化的miRNAs，其中miR-194-5p 通过调节细胞周期，阻止细胞从G1 期进入S 期并促进DNA 损伤反应，增强TRCs 的存活，进而调控E2F3 的表达，增强肿瘤细胞再增殖和重新聚集。

2.2 外泌体与耐药诱导相关研究

Boelens 等［17］发现间质细胞和乳腺癌细胞可通过分泌信号驱动化疗和放疗耐药，通过异型相互作用，外泌体从基质转移到乳腺癌细胞。外泌体中的RNA（主要是非编码转录本和转座元件）刺激模式识别受体RIG-I 激活stat1 依赖的抗病毒信号，促进对NOTCH3 的转录反应，并扩大治疗抵抗肿瘤起始细胞。研究［18］证明在胃癌中，外泌体miR-522 主要来自于肿瘤微环境中的CAFs。顺铂和紫杉醇激活USP7/hnRNPA1 轴促进CAFs 中miR-522的分泌，进而降低ALOX15 的表达，减少癌细胞中脂质ros 的积累，最终降低化疗敏感性。在表皮生长因子受体2 阳性（HER-2+）乳腺癌患者中，增强的miR-567 可以被包装成外泌体，整合到受体细胞中，通过靶向ATG5 抑制自噬和逆转曲妥珠单抗耐药［19］。异质肿瘤可从外泌体中获得耐药表型。实验证明［20］，短暂暴露于化疗药物可以显著增加Rab8 介导的耐药细胞释放含有ABCB1 的细胞外囊泡，并通过Rab5 的下调加速这些细胞外囊泡循环回到敏感肿瘤细胞的质膜上。细胞间ABCB1转移显著增强，敏感的癌细胞获得迅速但不可稳定持续存在的抗性，以逃避化疗药物的细胞毒性。研究发现放射治疗有助于改变外泌体的分泌动态，x 射线可以以剂量依赖的方式激活MCF-7 细胞外泌体的生成和分泌，细胞通过改变活性氧和外泌体活性实现治疗反应［21-22］。结直肠癌中，CAFs 来源的外泌体可以激活转化生长因子factorβ（TGF-β）信号通路，而TGF-inhibitor 1 中和抗体可抑制这一作用，降低干细胞基因的克隆性和表达水平，CAFs 分泌外泌体促进结直肠癌细胞的干性，从而增加辐射抗性［23］。癌细胞的照射促进了tet2介导的miR-378 启动子的去甲基化，miR-378a-3p过表达及其在外泌体中的负载，诱导NK 细胞颗粒酶b（GZMB）分泌减少，GZMB 表达降低导致NK 细胞毒性降低。故外泌体miRNA-378a-3p 在癌细胞中的过表达限制了自然杀伤细胞的细胞毒性，促进肿瘤进展［24］。

2.3 外泌体诱导免疫作用

肿瘤来源的外泌体（TEX）参与肿瘤的免疫抑制过程。TEX 将基因组DNA、mRNA 和miRNAs等信息传递到免疫细胞，重新编码应答细胞的功能，直接或间接影响免疫细胞的发育、成熟和抗肿瘤活性［25］。现已证明肿瘤和免疫细胞来源的外泌体携带肿瘤抗原并促进免疫，导致CD8+T 细胞和CD4+T 细胞活化，直接抑制肿瘤生长和对恶性肿瘤发展的抵抗［26］。在TEM 中，过表达的VEGF 和激活的VEGFR 以及磷脂酰丝氨酸由细胞和外泌体内膜到外膜的活化均可触发免疫抑制作用，如抑制免疫细胞Treg 对NK、NKT、CD4+、CD8+等抗原提呈细胞的抑制作用［27］。实验［28］证明，乳腺肿瘤细胞中上调CD73 表达的lncRNA SNHG16 可由癌细胞分泌的外泌体传递到Vδ1 T 细胞，SNHG16 通过海绵化吸收miR-16-5p 通过ceRNA 作用，导致其靶基因SMAD5 的失调，增强TGF-inhibitor 1/SMAD5 通路，上调Vδ1 T 细胞中CD73 的表达，证实了乳腺癌细胞来源的外泌体SNHG16/miR-16-5p/SMAD5 调控轴增强了TGF-cada1/SMAD5 通路的激活，从而诱导了CD73 的表达，增强T 细胞功能。

3 外泌体修饰

关于外泌体在肿瘤发生和治疗方面已有诸多研究，外泌体用作诊断工具主要涉及使用可控外泌体，而不是利用天然外泌体的特性。外泌体的来源细胞的特性常被改造以产生具有特定生物学特点修饰的外泌体。在肿瘤微环境中，外泌体是程序性死亡配体1（PD-L1）进入受体细胞的转运载体，远处的肿瘤细胞可以通过外泌体PD-L1 对激活的T 细胞进行远程攻击实现免疫逃逸［29］。对T 细胞进行修饰，效应CAR-T 细胞分泌的CAR 外泌体表面携带CAR，表达高水平的细胞毒性分子并抑制肿瘤生长，但不表达程序性细胞死亡蛋白1（PD1）并且重组PD-L1 治疗不会降低CAR-T 细胞外泌体的抗肿瘤作用。CAR 外泌体比CAR-T 细胞的治疗应用更安全［30］。另外，外泌体还可以通过添加肿瘤靶标配体进行修饰或功能化，有研究为了对外泌体进行基因修饰，使用两种不同表面的单克隆抗体，开发了一个用于控制细胞免疫的外泌体平台：SMART-Exo。Shi X［31］通过抗人CD3 和抗人HER2 抗体的基因展示工程化外泌体，将SMART-Exo 应用于表达人类表皮生长因子受体2（HER2）的乳腺癌，从而导致SMART-Exos 双重靶向T 细胞CD3 和乳腺癌相关的HER2 受体，通过重定向和激活细胞毒性T 细胞使其攻击HER2+的乳腺癌细胞。设计的SMARTExos 在体外和体内均表现出高度有效的特异性抗肿瘤活性。最近还有研究［32］提出用微流体超声处理方法，直接生成包含成像剂的外泌体膜（EM）、癌细胞膜（CCM）和脂质涂层聚乳酸-糖基乙酸（PLGA NP），由内体和质膜蛋白组成的肿瘤细胞来源的EM 包被的PLGA NPs 在体外和体内模型中均比大小和核壳结构相近的CCM-PLGA NPs 具有精确的同型靶向性。这种方法明显提高了抗肿瘤的特异性。实验［33］证明基于工程外泌体的抗结肠癌药物5-FU 和miR-21 共传递系统能有效的促进细胞摄取并显著下调5-FU 耐药细胞中miR-21 的表达。

4 前景与展望

外泌体的生物学作用在疾病中的研究仍在进行，并且针对其实用价值和各种病理的诊断和治疗的研究数量已大幅增加。这种优势在于对疾病进行检测和监测时，外泌体携带物质的复杂性提供了一个多功能的诊断窗口。外泌体在向病变细胞运送功能性货物时的特征特性使其成为较好的治疗载体，无论是在基础水平还是应用水平［34］。最近几年，科研人员一直都致力于探究外泌体的临床应用，包括外泌体作为生物标志物检测疾病的高效性和特异性、改造外泌体以提高其运载能力和外泌体在药物方面的应用。此外，外泌体作为细胞间的通讯媒介，其介导的核酸传递是一种很有前景的基因治疗策略［35］。总之，外泌体有望在肿瘤研究中取得进一步的进展，实现其在肿瘤早期检测，诊断及治疗中的临床应用。