特异位点DNA甲基化常用检测技术及应用进展

姚燕丽 黄宇哲 韩芝斌 曹春玲 吴静标

DNA 甲基化是表观遗传学领域研究的重点之一［1］。DNA 甲基化是指在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，基因组DNA 序列上CpG 岛的二核苷酸5′端胞嘧啶转变为5′甲基胞嘧啶。DNA 的异常甲基化通常发生在肿瘤的超早期，是肿瘤生长的“种子”因素［2］。CpG 存在两种形式，一种为分散型的中高度重复序列；另一种为高度聚集，形成CpG 岛［3］。CpG 岛中的CpG 一般是非甲基化状态，其异常甲基化与肿瘤息息相关。甲基化一般都是连续发生的，即某一CpG 位点发生甲基化，那么该位点上下游一定区域内的CpG 也发生甲基化。研究表明，基因组启动子区甲基化，会改变重要遗传基因表达，是导致癌症发生的原因之一［3］。随着癌症进程改变，甲基化也会动态改变。此外，不同肿瘤的甲基化图谱也存在明显的差异。综上，利用甲基化检测对肿瘤进行早期筛查具有很大应用潜力［4］。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），属于血液循环游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）的一种，作为近年来肿瘤领域检测的研究重点，在肿瘤无创前期早筛中具有重要应用价值。本文将综述甲基化的各检测技术，对DNA 甲基化的临床应用情况进行总结，分析相关产品目前存在的技术难点及未来发展趋势。

1 特异位点甲基化检测方法

有效的甲基化基因检测手段是应用的关键。近年来，市面上出现了不少DNA 甲基化的检测技术，发展已达十几种［5-6］，按照技术类型，分为甲基化特异性扩增技术［如甲基化特异性PCR、甲基化特异性半巢式/巢式PCR、甲基化敏感性限制性内切酶（methylation-sensitive restriction Endonuclease，MS-RE）-PCR/Southern 法）、甲基化测序检测分析技术（如亚硫酸氢盐测序、简化表观亚硫酸氢盐测序、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸（methylation-sensitive single nucleotide primer extension，Ms-SnuPE）］、甲基化基因芯片及图谱检测技术［如甲基化特异性寡核苷酸芯片、限制性酶切基因扫描技术、甲基化敏感性单链构象分析（methylation-specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）］、甲基化传感器检测分析技术（如基于OsO4 氧化的电化学传感器、化学氧化裂解诱导的指数扩增反应、基于比例竞争型定量PCR 的横向流动核酸生物传感器）［7］，此外，磁珠和油包水微液滴结构的数字PCR 技术（BEAMing 技术）、纳米芯片技术也被应用到DNA 甲基化的检测中。特异位点甲基化检测一般作为后期的技术验证手段。见表1。

表1 特异位点甲基化检测方法汇总Table 1 Summary of methods for detecting DNA methylation at specific sites

不同的特异性位点甲基化检测技术各有优劣势。总体而言，其检测覆盖范围可分为大、中、小三个程度［5-6］：大范围的检测是全基因组甲基化测序技术，检测位点广泛但费时费钱；中等覆盖度的检测可用芯片捕获测序技术，对热点进行针对性检测，成本较低；小范围则用甲基化特异性PCR技术，可对多个热点甲基化状态快速、准确检测，无需测序，费用相对低。目前应用最多的是后两种检测方法［10-11］。中低覆盖程度检测都需针对热点区域，设计特异性探针或引物，检测靶标区域的甲基化状态。热点区域的筛选，即生物标记物（biomarker）筛选，又称为靶标区域或靶标位点的筛选。见表2。

表2 甲基化biomarker 筛选方法Table 2 Screening methods of methylated biomarker

以上方法虽有一定应用性，但限制缺点较大。因此，研发新筛选方法，对DNA 甲基化检测和基于甲基化检测的肿瘤早期筛查具有重要意义。

2 DNA 甲基化的临床应用

DNA 甲基化的临床应用领域包括非肿瘤与肿瘤疾病［6-7］。非肿瘤甲基化检测主要用于炎症性疾病、代谢性疾病、感染性疾病、心血管疾病等［12-15］。肿瘤甲基化检测主要用于肺癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌等多种肿瘤的早期诊断和预后分析治疗等［16-19］。肿瘤中普遍存在DNA 异常甲基化，其特点是甲基化水平总体降低与局部升高。低甲基化可诱导原癌基因和转座子活化、基因印迹缺失以及染色体不稳定性增加，最终诱发肿瘤［20］。某些抑癌基因发生高甲基化，导致基因沉默，抑制肿瘤能力下降。见表3。

表3 部分基因甲基化对应肿瘤应用Table 3 Application of partial genes methylation in tumors

3 国家药品监督管理局产品获证情况汇总

目前，基于DNA 甲基化位点的检测产品陆续面世，给疾病诊断筛查带来福音。通过查阅国家药品监督管理局，国内已获证产品见表4。国内甲基化试剂盒转化商业产品集中在近几年，且获批的都为甲基化特异性PCR 技术，主要原因还是该技术操作简便、特异性强、灵敏度高等特点。目前甲基化检测试剂盒检测样本类型多为cfDNA，特别是ctDNA，其检测方法具有早期、无创、快捷、灵敏度高等特点。基于血液样本中ctDNA 的检测克服实体瘤组织样本的局限性，具有以下优点：①克服肿瘤组织取样的异质性；②可以识别肿瘤转移性；③可以重复活检，使肿瘤克隆演变得以追踪；④血液中ctDNA 半衰期仅有2 小时，实现实时监测肿瘤的变化。然而，血液ctDNA 含量很低，其检测技术的灵敏度要求较高。

表4 国内NMPA 获证情况Table 4 Products registered in NMPA

4 小结与展望

特异位点DNA 甲基化检测手段发展至今，技术应用依然存在成本高、检测量低、引物或探针设计不一影响效果等问题，因此，优化提升DNA 甲

基化检测技术亟待解决。新技术如纳米芯片技术、免疫组化与数字PCR 技术联合、微流控芯片与质谱联用或可应用到商用试剂盒检测中。稳定实现甲基化转化需要专业的数据分析人员对大数据进行分析，选择出优质的靶标及成熟的核酸提取纯化技术、超灵敏的PCR 或测序检测平台。基于ctDNA 的甲基化检测，解决了重复取样活检、组织采样存在异质性等问题。目前已实现转化的甲基化位点不多且特异性稍差，为了获得更高质量的ctDNA，建立国际或者国家标准的ctDNA 提纯分离方法或者纳入细胞系，对检出限、背景干扰进行研究验证至关重要。另外，是要检测整个DNA 甲基化水平还是位点特异性甲基化水平，或是全基因组水平分析还是位点特异性分析，是否需达到单核苷酸分别率等问题，是选择不同甲基化检测技术时需考虑的核心问题，也是未来筛选、应用、验证DNA 甲基化的研究方向，助力DNA 甲基化产品研发的关键。