抗VEGF治疗湿性年龄相关性黄斑变性的回顾与展望

王雅芳，刘 洋，罗学廷

上海交通大学附属第一人民医院眼科，国家眼部疾病临床医学研究中心，上海市眼底病重点实验室，上海眼视觉与光医学工程技术研究中心，上海市眼科疾病精准诊疗工程技术研究中心，上海200080

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）是一种导致老年人严重视力减退甚至失明的眼病［1］。AMD 分为干性和湿性，分别以地图样萎缩（geographic atrophy，GA）和脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）为特征。由于血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是CNV 生成的关键介质［2］，阻断或中和VEGF 表达的药物，如贝伐单抗、雷珠单抗、阿柏西普及康柏西普等在近10 年的临床治疗中成为主要选择。目前，玻璃体腔内注射抗VEGF药物，存在并发眼内炎、葡萄膜炎、医源性玻璃体出血及视网膜色素上皮撕裂等风险［3-5］。由于抗VEGF 药物半衰期短，为了维持功效，需要每4～8周进行重复的眼内注射。频繁注射带来的不便及高昂的价格使患者的依从性降低。VEGF不仅是内皮细胞特异性的因子，其在视网膜细胞中也广泛表达，故对维持视网膜的结构和功能具有重要作用［6］。长期的抗VEGF 治疗可能会导致视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）萎缩、脉络膜萎缩及GA 的发生率升高［7-9］。多中心临床研究［10］发现：部分患者在抗VEGF治疗7年后，其视力降至基线甚至基线水平以下，可伴随黄斑萎缩和纤维化的发生。因此，使用抗VEGF药物靶向抑制CNV同时，需要注重保护光感受器和RPE功能。为了改善湿性AMD 患者的治疗效果，必须开发出替代或补充治疗来降低视网膜的毒性反应。本文就抗VEGF治疗湿性AMD的研究进展做一综述。

1 Anti-VEGF基因治疗

基因治疗具备长期稳定表达治疗性蛋白以治疗视网膜疾病的潜力，可以较好地解决抗VEGF 药物多次注射带来的问题。腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是用于临床基因治疗较有前景的基因载体之一，其介导的基因递送可使外源基因在体内感染组织长期表达。RPE、Muller 及神经节细胞在病理状态下都存在分泌VEGF的可能，这便造成了靶细胞种类多或难以转染的问题。而重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV） 介导的分泌基因疗法（secretion gene therapy，SGT）恰好解决这一困扰，其显著优势在于转染的靶细胞不一定是产生VEGF 的细胞，而是较易获得和高效转染的细胞，紧接着借助组织间液流动和扩散来促进重组病毒产生的治疗剂（分泌蛋白）的分布和递送［11］。

1.1 AAV-sFLT-1

CNV 的治疗靶点——VEGF 主要通过FLT-1（fms 样酪 氨 酸 激 酶/VEGFR1） 和FLK-1/KDR （胎 肝 激 酶/VEGFR2） 高亲和力结合，介导血管生成［12］。其中，FLT-1 与VEGF 的亲和力远高于FLK-1/KDR。作为处于胞外结构域的FLT-1 天然存在的截短和分泌形式，sFLT-1 与VEGF 结合后无法启动信号转导，同时与FLT-1 和FLK-1/KDR 的胞外结合区形成异二聚化复合物，最终抑制了VEGF的促血管生成的作用［13］。

Lai等［11］在大鼠视网膜下注射编码sFLT-1的rAAV载体，重组载体于注射区域转染细胞，其分泌的sFLT-1 在视网膜扩散并且具备长期抑制激光诱导的CNV 的能力。为了进一步观测AAV-sFLT-1 的长久疗效，该团队使用光感受器特异性VEGF 上调的Vegf029 转基因小鼠，发现AAV 的转基因表达持续8 个月，抑制了新生血管的生成，同时维持了视网膜的形态和功能，且没有出现临床或组织学上可检测到的毒性现象［14］。视网膜下注射该病毒载体在眼中诱导瞬时和自限性炎症反应，但是其对sFLT-1的表达并没有影响，也未引起局部眼组织以及宿主系统性炎症反应［15］。Lai等［14］进一步选择激光诱导猴CNV的模型作为治疗对象，因为猴眼有视网膜-脉络膜循环和黄斑解剖结构，与人眼更为相似。该研究将AAV 载体注射至黄斑区，其抗血管疗效持续17 个月，且未造成视网膜的损伤及炎症。

鉴于用AAV-sFLT-1 于非人的灵长类动物的视网膜下注射并不会导致严重的不良事件、视力障碍、眼外载体的传播及对机体有害的免疫反应［16］，研究者开展了相关的临床试验。Ⅰ期临床试验中，6例继发中心凹下活动性CNV 的AMD 患者参与视网膜下AAV-sFLT-1的注射研究，在1 年的随访期间内没有发生归因于AAV-sFLT-1 的眼部或全身不良事件［17］。该试验再次验证了该基因治疗良好的安全性及耐受性。Ⅱa 期试验将32 例活动性的湿性AMD 患者以2∶1（基因治疗∶对照）的比例随机化分组，进行52 周的随访。结果发现：sFLT-1 蛋白在靶组织（视网膜）外的生物分布是有限的和短暂的，并没有引起机体的系统性反应；同时，相较于对照组，基因治疗组的雷珠单抗治疗（有活动性CNV 时，施行抢救治疗）次数较少［18］。Ⅰ期和Ⅱa期入组人员长达3年的随访结果显示，接受基因治疗的患者具备良好的耐受性且发生GA的倾向性较低，始终保持着较有意义的视觉改善，极具替代传统的抗VEGF治疗的潜力［19］。

视网膜下注射的方式相较于玻璃体腔注射具有较高的转染效率且不易诱发抗AAV 血清抗体，但术中需要切除部分玻璃体，因此术后视网膜脱离和白内障的风险也随之而至［20］。玻璃体腔注射的侵袭性较小，是长期以来抗VEGF 采用的给药模式，相关研究同样有所开展。在小鼠高氧诱导的视网膜病变模型中，玻璃体腔注射AAV2-sFLT-1有效抑制视网膜血管的生成，同时表达期长达12个月且未检测到组织学的毒性［21］。在非人灵长类动物的CNV 模型中，AAV 有效转染细胞，同样有着抑制血管生成的功效［22］。通过在食蟹猴眼内施用AAV2-sFLT-1后进行彻底和广泛的安全性评估发现：AAV 衣壳可诱发轻度炎症但可自行消退，而视网膜没有组织学和功能学上的损害［23］。Heier 等［20］开展了玻璃体腔注射AAV2-sFLT-1的Ⅰ期临床试验，结果显示安全且耐受性良好。

1.2 AAV-VEGF-Trap

研究［24］显示，与对照组相比，尽管使用AAV-sFLT-1的治疗组的雷珠单抗复治率较低，但仍需要补充推注抗VEGF 药物，并不能实现基因治疗单次注射的显著优势。这可能是因为与常规使用的抗VEGF 药物（阿柏西普或雷珠单抗） 相比，sFLT-1 对VEGF-A 的亲和力较低。Aflibercept是一种重组融合蛋白，由VEGF受体-1和受体-2 的胞外结构域部分同IgG1 的Fc 部分融合而成［25］。有研究［24］发现：玻璃体腔注射介导aflibercept过表达的rAAV能够有效抑制激光诱导的小鼠模型中CNV 的形成。由于aflibercept 过表达可能存在视网膜毒性，需要调节应用时间和剂量，为此该研究引入了由适配体结构域（配体传感原件）与表达平台（核酶）融合而成的核糖开关。活化配体与适配体结构域结合后依次活化核酶，进而改变构象来发挥作用。该开关分为“ON”型及“OFF”型，前者在和适配体结合后，目的蛋白由低表达转为高表达状态，“OFF”型则与之相反［26］。Reid 等［24］将“OFF”型TC45 核糖开关（活化配体为四环素） 掺入rAAVaflibercept 转基因盒，结果发现口服四环素可以有效抑制眼内aflibercept的表达，CNV的严重程度也随之改变。通过调节口服活化配体的剂量和频率，及时调整转基因的表达，将产生更强的临床适应性且有望实现患者的个性化治疗。目前，该研究尚未开展相关的临床试验。

1.3 RGX-314（AAV-anti-VEGF Fab）

RGX-314 是由Regenxbio 公司研制开发的编码单克隆抗体片段基因的NAV AAV8 载体，其表达的抗VEGF 的Fab 结构域可中和VEGF 活性。通过该基因疗法，在动物的眼睛中检测到抗VEGF 蛋白，抗VEGF Fab mRNA 和蛋白在整个视网膜中广泛分布［27］。在具有与黄斑变性相似症状的临床前动物模型中，单次视网膜下注射RGX-314后观察到显著的剂量依赖性的血管生长减少，并且延缓了疾病的进展［27］。通过RGX-314 在非灵长类动物依赖于临床剂量的毒性研究［28］发现：1×1010vg/眼剂量下的RGX-314 没有诱发任何视网膜功能损伤；而在1×1012vg/眼的高剂量下出现猴的视网膜电图波幅降低，至3个月时视网膜达到最大程度损害，且稳定于该水平。研究人员对剂量的调控引起重视。该公司发布的临床Ⅰ期试验数据显示：所有剂量下的RGX-314注射均安全且耐受良好，其蛋白表达水平具有剂量依赖性［29］。

2 抗血小板衍生生长因子和抗VEGF 的联合治疗

病理性新生血管对于单一抗VEGF疗法存在抗性［30］。血管内皮细胞可通过分泌血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）募集周细胞［31］。周细胞一方面覆盖内皮细胞给予结构的支持，另一方面通过自分泌或旁分泌的方式为其提供VEGF 给予功能的支持［31］，由此来建立成熟的血管系统并减轻了对外源性VEGF 的依赖［32］。此外，有试验表明：单一的抗VEGF 治疗并不能阻止视网膜下纤维化的发生，患者最终出现不可逆的视力损害［33］。脉络膜周细胞在损伤早期渗入视网膜下，参与细胞外基质的沉积，对于纤维化的形成起着重要作用［34］。从CNV的形成到其愈合反应后的纤维化，单一抗VEGF 治疗的局限性与周细胞密切相关，抗PDGF 的治疗也因此逐渐走进人们的视野。 E10030 （Fovista，Ophthotech 公司）是一种32 聚乙二醇化的DNA 适配子，分别选择性结合PDGF-BB 和PDGF-AB 的同源二聚体及异二聚体，从而破坏与其同源酪氨酸激酶受体的相互作用［35］。E10030 可以减少周细胞对血管的覆盖［36］。也有研究［37］发现，抗PDGF 与抗VEGF 有协同抑制小鼠CNV生成的作用。

Jaffe 等［30］进行了在玻璃体腔内联合注射E10030 和雷珠单抗的为期12周的Ⅰ期临床试验：在E10030剂量递增下（0.03～3 mg），机体的耐受性良好，并未检测到眼内和系统毒性；并且，患者的视敏度（visual acuity，VA）得以提升且中心凹厚度下降，CNV 减退。由此可见，E10030 和雷珠单抗的联合治疗具有有利的短期安全性［30］。在对449 例患者为期24 周随访的Ⅱ期临床试验中，从抗VEGF单一疗法（平均VA：6.5个ETDERS字母数）、0.3 mg E10030 联合治疗（平均VA：8.8 个ETDERS字母数）及1.5 mg E10030 联合治疗（平均VA：10.6 个ETDERS 字母数）的疗效来看，其剂量-反应关系是明显的；同时，1.5 mg E10030联合治疗下患者的VA改善度的相对大小逐渐增加［35］。回顾性掩蔽分析显示E10030联合治疗与抗VEGF 单药治疗比较，在限制纤维化的发展方面更有效［35］。然而，Ophthotech 公司发布Ⅲ期临床试验结果：1.5 mg E10030 联合阿柏西普或贝伐单抗治疗12 个月后，相较于对照组，平均VA 变动基本少于1 个ETDERS 字母数，且记录数据无统计学意义［38］。有研究［39］发现：接受抗VEGF 治疗后2 年，将近半数患者出现了眼底纤维化。由此推测，由于该Ⅲ期试验采用1年作为评估终点，此时，患者眼底可能还处于CNV 反复生成的时期，尚未进入纤维化阶段，使得抗PDGF药物尚且无法发挥作用，导致最终试验结果不甚理想。此外，随机临床试验发现：在抗VEGF 治疗后第1 年观测到VA 的改善，而在第2年VA 的改善度维持或提高［40］。也许Ⅲ期试验的治疗效果在短期之内无法体现，适当延长治疗终点可能会观察到VA较为明显的改善。

3 补体相关基因治疗

机体对抗VEGF 药物的反应性受到了补体因子H（complement factor H，CFH）风险等位基因的影响［41］。CFH 基因负责编码补体旁路途径的主要调节因子。高风险CFH 基因型可能通过增加老化脉络膜毛细血管周围的攻膜复合物（membrane attack complex，MAC）的沉积来影响罹患AMD 的风险［42］。此外，研究发现：补体通路中复合物的沉积可能通过破坏脉络膜毛细血管中的内皮细胞导致血管密度降低，进而促进玻璃膜疣（RPE 异常代谢物沉积）的形成，最终介导GA的发生［43］。而GA正好是长期抗VEGF 出现的不良反应之一。保护脉络膜内皮细胞免受补体介导的裂解损伤的方法将有望弥补这一缺点，更有效地治疗AMD。在激光诱导的CNV 模型中，MAC 有显著沉积的现象［44］。CD59，也称为反应性裂解的保护素或膜抑制剂，可以有效地抑制膜上MAC 的形成［45］。

动物研究发现：视网膜下注射表达hCD59（human CD59）的重组腺病毒（adenovirus，Ad）载体能够有效阻碍RPE 细胞上MAC 沉积及免除MAC 介导的损伤和囊泡化［46］。通过视网膜下注射的Ad载体或玻璃体腔注射的AAV载体递送人可溶性CD59（AdCAGsCD59/AAVCAGsCD59）皆能有效地减少小鼠CNV 斑点上MAC 的沉积并抑制CNV［47］。已有研究招募了玻璃体腔注射AAVCAGsCD59的Ⅰ期临床试验患者（NCT03585556）。

4 总结

在湿性AMD 的治疗中，反复注射抗VEGF 药物一方面造成治疗的不便，另一方面可能存在视网膜毒性，最终导致患者的视力无法得到较好的提升。为了弥补该疗法的弊端，其相应的基因治疗联合PDGF和补体相关的治疗方法不断推陈出新，逐渐从临床前研究走向临床试验，为AMD 现有的治疗提供了新的思路，也给患者带来了新的希望。通过对注射剂量、注射方式等进行充分评估，抗VEGF 的替代或补充治疗的安全性、耐受性及有效性正逐步提高。

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