NLRP3炎症小体在炎症性肠病及炎症相关性肠癌作用中的研究进展

胡 韵，陆 军，王章桂

(1.安徽理工大学医学院2018级临床检验诊断学专业；2.安徽理工大学第一附属医院检验科，安徽 淮南 232001；3.安徽省第二人民医院放疗科，安徽 合肥 230000)

炎症小体是细胞内组装成的一种多蛋白信号复合物，在受到外界刺激中特定的微生物成分和内源性分子刺激可导致炎症小体的组装和半胱氨酸蛋白酶前体(procaspase-1)活化，随后IL-1β和IL-18前体(proIL-18)裂解成活性形式使细菌病原体诱导的吞噬细胞死亡[1]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体样受体(nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containing receptor，NLR)家族成员NLRP1、NLRP3和NLRC4、热蛋白(pryrin)、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)等已被证实参与了炎症小体的组装过程[2-3]。NLR通常由感应器模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)、适配器接头凋亡相关斑点蛋白(apptosis associated apeck-like protein containing a CARD domain，ASC)和procaspase-1[3]组成。目前NLRP3炎症小体是众多科研实验研究的最多最深入的炎症小体类型之一，它在人类众多炎症及肿瘤类疾病的不同发生发展阶段中起到了重要作用。低水平的炎症是胃肠道高抗原环境中免疫系统和微生物群之间平衡的一个组成部分，宿主对微生物病原体的防御和肠道内的组织维持着一个稳态，它们的失调可能导致炎症性疾病和肠癌，NLRP3已被Singh等人[4]证实其对结肠炎有保护的作用，在进一步的炎症作用下NLRP3炎症小体在炎症相关性结直肠癌的发生发展进程中也起了重要作用。本文综述了NLRP3在肠道炎症中的作用，并介绍了将NLRP3作为炎症性肠病和结肠炎相关结直肠癌治疗靶点的一些机会。

1 NLR家族和NLRP3炎症小体

1.1 NLR家族先天免疫系统是人体防御的第一道防线，通过模式相关识别受体在受到有害刺激如侵入的病原体、死亡细胞或环境刺激物时激活，PRRs通常识别由内源性应激反应产生的独特的微生物病原体成分，称为病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMPs)或损伤相关分子模式(damage associated molecular pattern，DAMPs)，并由此触发下游一系列炎症因子途径以抵抗微生物感染来修复受损的器官和组织细胞[5]。目前已经发现的RPPs[5-6]主要包括三类，包括Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)，RIG-I样受体(RIG-I like receptor，RLR)，NOD样受体(NOD like receptor，NLR),其中NOD受体通常含有一个与配体结合的亮氨酸富集结构域(leucine-rich repeat，LRR)位于蛋白C端，蛋白N端包含一个接头蛋白-含有半胱天胺蛋白酶激活招募结构域(caspase recruitment domain，CARD)或一个热蛋白结构域(pyrin domains，PYD)。蛋白NLR[3，5]家族成员主要包括NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRC4、NLRC5、NLRP6、NLRP7、NLRP12和pryrin，以及在黑色素瘤中起作用的AIM2。目前已经证实了NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2等相关模式识别受体都可以参与炎症小体复合体的组装过程，其中NLRP1和NLRP3炎症小体参与了肌萎缩侧所硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)的病理进展过程[6]。

1.2 NLRP3炎症小体组成和特性NLRP3炎症小体多蛋白复合物的组装需要由传感器NLRP3模式识别受体、含有半胱天冬氨酸蛋白酶募集结构域的适配凋亡相关斑点蛋白ASC和效应蛋白caspase-1参与构成，其中NLRP3模式识别受体是一种细胞内的传感器，可检测多种微生物基序、识别多种内源性危险信号和环境刺激物，从而与其他成分共同激活和促进NLRP3炎症小体复合物的组装过程，NLRP3炎症小体复合物的组装可导致caspase-1依赖性的促进释放IL-1β和IL-18等促炎性细胞因子，并导致细胞的热休克死亡[6-7]。NLRP3炎症小体复合物广泛存在于发生疾病的各种免疫细胞中，包括粒细胞、抗原提呈细胞、T、B淋巴细胞。

2 NLRP3的激活与调控

NLRP3炎症小体作为天然免疫环节中的重要组成部分之一，是识别PAMPs致病相关分子模式或DAMPs损伤相关分子模式的关键信号。在静息细胞中NLRP3炎症小体组装的活化是一个需要两个信号启动的过程。第一个信号由微生物分子(TLR配体)或某些通过核因子κB (nuclear factor kappa-B，NF-κB)蛋白信号诱导NLRP3间接促进炎症小体复合物的组装表达[8]。第二个信号由多种刺激物介导，包括细胞外ATP、颗粒物和某些细菌毒素直接触发caspase-1的激活，并与ASC和NLRP3适配器组装成炎症小体复合物介导成熟IL-1β的切割和释放[9]。这两种不同的途径共同导致NLRP3活化。目前根据已有的实验还不能证明在信号2激活NLRP3的途径中NLRP3的激活物配体分子能与NLRP3直接作用。NLRP3炎症小体的激活在信号2途径中可以由不同激活物激活而引起下游蛋白变动等一系列细胞事件。所以NLRP3激活的统一机制的仍然是不确定的。Kahlenberg等人[10]研究了细胞外ATP通过ATP激活的P2X7受体(P2X7R)和细菌毒素以P2X7R依赖的方式激活NLRP3,诱导强大的K+流出，这一信号似乎是NLRP3激活所必需的。尽管高浓度的细胞外K+有效地阻断了炎症反应的激活，但目前尚不清楚K+流出是否是由激活NLRP3复合物的所有刺激物诱导产生的。二氧化硅[11]和其他颗粒物引起的细胞溶酶体膜的损伤可通过激活溶酶体蛋白酶，特别是组织蛋白酶在NLRP3活化中起重要作用。然而，由ATP诱导的caspase-1活化与组织蛋白酶的激活无关，提示组织蛋白酶的激活不是NLRP3活化的统一环节中的必要步骤。NLRP3的激活刺激物，包括ATP、晶体和内毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)都能诱导活性氧簇(reactive oxygen speciesR，ROS)的产生。Kim等[12]研究证明炎症小体NLRP3在肾小管细胞中缺氧损伤后线粒体ROS的产生和损伤中起重要作用。在不存在炎症小体NLRP3的情况下，这种线粒，体调控增加了单侧输尿管梗阻后细胞的自噬，并减少了细胞的凋亡。尽管ROS和线粒体在NLRP3炎症小体的激活对抗感染和炎症过程中对宿主防御有很大的帮助,但它们的确切功能机制还没有完全阐明。但其效应蛋白IL-1β和IL-18的过度分泌会导致炎症性增加，从而增加患者发生肿瘤的风险。

3 NLRP3炎症小体与炎症性肠病

3.1 炎症性肠病炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)包括两种不同的疾病，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’S disease，CD)。克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)，患者的主要临床特征是胃肠道慢性炎症和复发性炎症。UC和CD的区别在于临床组织学和内镜标准，在UC中，炎症仅限于结肠粘膜层，并可以持续延伸到结肠的其他区域，而在CD中，炎症是跨壁的并且可以以不连续的方式发生，涉及胃肠道的任何部分[13]。

3.2 NLRP3在IBD中的粘膜免疫反应肠道粘膜损伤可能是先天性免疫反应失调的结果,小檗碱可以调节肠胶质细胞(enteric glial cells，EGCs)、肠上皮细胞(intestinal epithelial cells，IECS)和免疫细胞在共培养系统中的相互作用，其中 EGCS、IECS和免疫细胞间相互作用可能是肠道黏膜炎症反应中的重要环节[14]。NLRP3炎症因子在肠内稳态和IBD中胃肠环境中的作用是一个连续的系统，当发生炎症性肠病时胃肠道粘膜内提供大量免疫细胞靶向杀死环境毒素和潜在细菌病原体。越来越多的证据表明，粘膜表面(尤其是肠内)的先天免疫识别是肠内稳态的重要条件。因此，了解控制肠内异常天然免疫反应的调节对阐明炎症性肠病的发病机制至关重要。近年来的临床研究也显示IBD患者结肠组织和巨噬细胞分泌的和NLRP3炎症小体相关的促炎细胞因子IL-1β表达量增加，研究显示IL-1β水平的升高与IBD的病情严重程度有关[15]。

3.3 NLRP3在IBD中动物模型实验动物实验虽然不能完全模仿IBD的所有临床表现和发病机制，但各种实验性结肠炎小鼠模型已被开发用于研究IBD的发病机制。葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)模型已广泛应用于结肠炎免疫机制的研究。钟海平[16]等人让大鼠口服含DSS饮用水可通过破坏肠道内共生菌的存在，直接损伤结肠上皮细胞并引发持续炎症，该模型导致大鼠体重减轻、腹泻、直肠肛门出血甚至死亡等临床特征，组织病理学切片分析显示广泛的隐窝细胞和上皮细胞损伤，巨噬细胞和中性粒细胞明显浸润，组织水肿和溃疡，这一结果与溃疡性结肠炎患者的病理结果相似。采用突变小鼠的早期研究证实，活化的caspase-1对DSS诱导的炎症至关重要，Wang等人[17]研究炎症蛋白ASC和caspase-1的缺乏在DSS诱导的结肠炎的急性期和慢性期均造成更大的结肠炎相关致死率和更严重的组织病理学改变。因为caspases-1或ASC缺乏的小鼠比野生型(wide type，WT)小鼠的病理学严重程度要低得多，这与IL-1β、IL-18分泌水平的降低有关，提示这两者的过量分泌可加重DSS诱导的小鼠结肠炎的发生。同时肠上皮细胞在受到刺激后其NLRP3炎症小体的激活可能触发粘膜上细胞修复反应，其特征是在肠的隐窝底部的干细胞分裂增加，以替换受损的肠粘膜细胞。另外，在急性结肠炎小鼠模型期间，NLRP3-/-和caspase-1-/-基因敲除小鼠胃肠道上皮细胞的增殖减少。活化的NLRP3炎症小体下游的IL-1β和IL-18分泌导致肠道上皮细胞的通透性增加阻碍了肠道细胞的修复。在急性三硝基苯磺酸盐(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)诱导的结肠炎模型[18]中，小鼠体重减轻、腹泻、直肠出血和死亡率增加，使用黄芩素(5,6,7-trihydroxyflavone)通过降低髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性和促炎介质的表达，减轻了TNBS所致小鼠结肠炎的严重程度，黄芩素还可以降低NLRP3炎症小体的活化和下游IL-1β的表达，使其分泌呈剂量依赖性。

3.4 IBD中NLRP3与微生物作用IBD的发病机制可能与肠道微生物种群组成的失调或种类改变有关。在NLRP3-/-小鼠中可以观察到微生物群的数量和组成均有变化，NLRP3-/-小鼠结肠分析中的细菌种类和含量比同组野生型小鼠多，冯等人[19]结肠细菌分析研究表明，NLRP3-/-小鼠结肠中增加的细菌属于苏云金芽孢杆菌属，包括不同的梭状芽孢杆菌、杆状细菌等。利用实验小鼠监测其微生物群的变化，剖析NLRP3炎症体和肠道微生物群之间的复杂串扰发现过度活跃的NLRP3炎症小体导致局部产生IL-1β，可以维持肠道内稳态，并通过重组肠道微生物群对实验性结肠炎产生强大的抵抗力，该微生物群由于调节性T细胞的诱导而增强了抗炎能力。

3.5 IBD中NLRP3与ROSROS是指一类特殊的含氧化合物，其化学活性远高于氧，正常情况下，基础水平的活性氧具有杀菌作用，NLRP3炎症小体在受到刺激物激活后能诱导ROS的产生参与肠道防御过程。Makhezerd等[20]研究发现IBD中主要炎症细胞因子NOX1的激活和ROS的产生对结肠上皮细胞产生脂钙蛋白-2(lipocalin-2，LCN-2)有影响。在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF)和IL-17联合作用后，NOX1活性和ROS生成明显增加，细胞中中性粒细胞炎性浸润产生的过量ROS可引起蛋白水解酶氧化应激(Oxidative Stress，OS)反应，内皮细胞受到氧化应激后进一步引起肠粘膜屏障损伤随后肠道细菌病原体入侵，最终导致肠粘膜坏死和溃疡 。ROS通过控制LCN-2的主诱导剂的表达来驱动TNFα和IL-17而影响IBD的进展过程。杨威等人[21]研究也证实了TNFSF15基因rs4263839位点变异不仅可能降低UC的临床发病风险，还可能影响UC发病的严重程度和UC发病的不同部位。此外，Makhezer他们在TNBS诱导的结肠炎过程中，还观察到NOX1缺乏的小鼠也通过产生LCN-2和ROS来降低结肠损伤。有研究证实出累积的ROS还可以作为激活细胞内信号通路的第二化学信使，通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路，影响肠道细胞的增殖、分化和凋亡[22]。当NLRP3炎症小体的激活剂诱导ROS产生时，用相应的药物抑制剂阻断ROS的产生可以抑制NLRP3炎症小体的激活。这些研究表明，由NLRP3炎症小体激活诱导的ROS的产生是肠道黏膜免疫中的一个重要环节。

4 NLRP3炎症小体与炎症相关性结直肠癌

4.1 炎症相关性结直肠癌肠炎相关性肿瘤中的结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是美国癌症死亡率的第三大常见原因，CRC是消化道肿瘤中常见的恶性肿瘤，发病率高，死亡率高。遗传倾向和反复发生的炎症性肠病是CRC的发生有两个主要的独立危险因素。即使在临床的散发性结肠癌患者中，80%的结肠癌的发生都与肿瘤抑制因子结肠腺瘤性息肉基因的(Adenomatous Polyposis Coli，APC)突变有关[23]。尤其对于晚期结直肠癌的患者，手术以外的治疗效果非常有限。因此，不断寻找治疗结直肠癌的药物新靶点，优化诊疗方法，对促进CRC患者的预后生存具有重要意义。近年来，含有核苷酸结合域和富含亮氨酸重复序列受体NLR受体在肠癌发生发展中的重要作用被认为可能为CRC的治疗提供新的策略。

4.2 NLRP3在CAC中动物模型实验Lee等人[24]利用 APC基因突变的小鼠(ApcMin)建立自发性结肠癌模型，先天免疫信号和共生细菌在该小鼠模型中被证明是重要的，无细菌的APCmin/+小鼠的小肠肿瘤发生率略微降低。在该模型的研究中发现，NLRP3炎症小体在自发性肿瘤发生中似乎没有作用，因为与IL-1受体(IL-1R)或caspase-1缺陷小鼠杂交的APCMin小鼠在息肉形成方面与APC小鼠没有差异。另一方面，在炎症存在的情况下，炎症小体在结肠癌的发生中起着关键作用。肠炎相关性结直肠癌CAC是IBD后续的主要并发症，与结肠炎的严重程度和持续时间直接相关。Rospo等人[25]研究证明慢性持续炎症和癌变之间的紧密联系可以通过NLRP3炎症小体诱导产生DNA损伤性ROS来解释ROS的产生是促进细胞存活、促进增殖和血管生成以及组织细胞重塑的促炎介质形成有利于肿瘤发生的免疫微环境。另一种广泛使用的CAC小鼠模型是偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)AOM/DSS模型，其中实验性致癌物AOM通过甲基化氧化引入基因组突变，然后重复一轮喂食含DSS的水以诱导慢性结肠炎。经过三轮DSS的诱导后，小鼠出现明显可见的腺瘤，如果在稍后的时间点处死小鼠，则腺癌的比例增加，这表明该模型再现了人类从癌前腺瘤到腺癌发展过程中涉及的事件[26]。这个模型在识别对炎症和随后的致癌过程有重要调节作用的因子和信号途径方面是有用的。鉴于炎症与结直肠癌之间的紧密联系，有研究证实了在化学性损伤后保护肠道粘膜免受过度炎症因子浸润的NLRP3炎症小体在CAC进展中发挥了重要作用，NLRP3炎症小体在结直肠癌发生中的作用机制提示IL-18的抗肿瘤作用体现在不仅抑制肿瘤的生长，而且抑制血管生成，有利于诱导上皮细胞的恢复。在用AOM/DSS建立的caspase-1缺陷动物模型中[27]给予重组IL-18可显著阻止肿瘤的发展，这说明通过NLRP3分泌的IL-18对防止结肠炎恶性转化、促进肠上皮细胞分化和肠上皮完整性具有重要作用。在疾病急性期，IL-18可能通过诱导隐窝基底部干细胞的控制性增殖和损伤上皮细胞的翻转，有助于恢复上皮屏障的完整性。这可以防止共生菌群的系统性分散和过度炎症反应的诱导。然而，在结肠炎的缓解期和慢性期，IL-18可能会抑制结肠上皮肿瘤区域中上皮细胞的增殖。有研究发现[28]这一结果可能是通过诱导干扰素γ(interferon gamma，IFNγ)的产生来实现的，因为在AOM/DSS处理的Nlrp3-/-和caspase-1-/-小鼠的结肠中，IFN-γ的产生显著减少。此外，在AOM/DSS模型中，与野生型小鼠相比，Casp-11基因敲除小鼠对AOM/DSS建立的CAC模型小鼠高度敏感。在疾病进展过程中，Flood等[29]发现信号在原代小鼠巨噬细胞和肠上皮细胞中可诱导caspase-11的表达和STAT1的激活。这些发现揭示了caspase-11和NLRP3炎症小体在CAC中的抗肿瘤作用，并提示caspase-11的关键作用是连接IL-1β和STAT1之间的信号通路。

4.3 CAC中NLRP3与MyD88有研究发现在IL-18信号下游髓样分化因子(Myeloid differentiation factor88，MyD88)信号在氮氧甲烷AOM/ DSS模型建立的炎症性相关肠癌CAC的发生进展中具有保护作用，MyD88-/-基因缺陷小鼠不能治愈损伤后产生的粘膜溃疡，由于肠道周围炎症环境的改变，导致促炎因子基因的早期表达改变，调节了细胞增殖、凋亡和DNA修复等途径，加快了腺瘤的形成和向浸润性腺癌进展同时伴有β-连环蛋白(β-catenin)基因频繁的克隆突变[30]。另外，在AOM/DSS模型中，IL-18-/-和IL-18R-/-小鼠比野生型小鼠更容易发生炎症性肠病中结肠炎和息肉形成，提示MyD88/-小鼠的表型部分是由于它们无法通过IL-18受体进行信号传递所致。这项研究揭示了以前未知水平的围绕MyD88活动下游不同受体的复杂性来影响肠组织稳态和癌变。

5 结语与展望

目前，对NLR受体家族相关的炎症小体与各种癌症的研究实验已经有很多。炎症相关性肠癌中的NLRP3炎症小体的组装通常被认为是对细胞损伤和病原体感染有益的宿主反应。尽管NLRP3的遗传连锁研究目前还缺乏，但其与CD发育易感性增加的相关性促使人们分析其在炎症相关性肠癌发生发展中的作用。由于器官的异质性，不同的动物实验模型，以及在结肠炎及其相关肠癌发生发展不同阶段的复杂性，很多实验的结果并不一致。进一步明确NLRP3炎症小体在炎症复杂情况下的精确作用非常重要。此外，在结肠炎及其相关肠癌的发展进程中，肠道微生物的变化以及肠道免疫粘膜反应都分别影响了NLRP3炎症小体的形成，这些都是目前该研究领域的重点。通过研究各种疾病以及动物模型实验研究结果中NLRP3炎症小体及促炎性介质的确切变化，可为炎症性肠病及炎症相关性肠癌的防治提供新的靶点和策略。