从肿瘤免疫微环境角度看免疫治疗疗效预测标志物

白日兰 崔久嵬

作者单位：130021 长春 吉林大学第一医院肿瘤中心

免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）治疗开创了抗肿瘤治疗的新纪元，目前已在多个肿瘤中观察到持久应答和显著的生存优势[1-2]。然而，大多数患者并不能从ICIs治疗中获益。近年来，对ICIs疗效预测生物标志物的鉴定和开发越来越受到重视。肿瘤组织往往与其赖以生存的微环境相依相行，而肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment，TIME）是一个极为复杂的体系，其内在的各种免疫细胞、基质细胞及细胞因子均可与肿瘤细胞相互作用，且这些免疫系统网络的调控与肿瘤存在着复杂的相互作用并对肿瘤发生发展和免疫治疗应答产生重要影响。同时，TIME也是一个异质性环境，个体的免疫状态往往是各因素随机化的结果，因此需要寻找所有因素相互作用的结果总和，才能有效并准确地预测TIME对肿瘤免疫应答的整体影响。近年来，随着多重免疫组化技术、高通量测序和微阵列技术的发展和不断完善，人们对TIME的了解也逐步深入，并开发了基于肿瘤和微环境的ICIs疗效联合预测生物标志物模型。而这些生物标志物的开发有助于揭示ICIs的治疗机制及肿瘤与TIME的相互作用机制，实现个体化抗肿瘤免疫治疗决策，监测治疗疗效和疾病发展，指导临床试验设计并进一步了解耐药机制及预后。本文从TIME角度出发，概述免疫治疗疗效预测生物标志物的研究进展，以及基于肿瘤和免疫微环境因素开发的联合预测模型。

1 肿瘤微环境免疫表型

1.1 肿瘤微环境整体免疫表型

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）的整体状态与免疫治疗疗效具有相关性，基于深度学习衍生的“计算机染色”可获得标准的病理癌症图像并用于鉴定肿瘤TILs[3]。根据TIME中免疫细胞状态可将肿瘤免疫浸润模式大致分为免疫炎症型、免疫排除型和免疫沙漠型三种[4]。免疫炎症型的特征是肿瘤实质中存在CD8+和CD4+T细胞，并伴随免疫检查点分子的表达[5]，提示此类肿瘤对ICIs治疗具有潜在的抗肿瘤免疫反应[6]。免疫排除型的特征是在肿瘤侵袭性边缘或间质中存在不同的免疫细胞类型，但不能浸润到肿瘤实质中[4，7]。有研究对抗程序性细胞死亡受体1（programmed cell death 1，PD-1）/及其配体（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）治疗前的样本进行分析，结果显示，应答者侵袭性边缘的CD8+T细胞丰度相对较高，治疗期间连续采样显示CD8+T细胞浸润肿瘤实质增加[8]。免疫沙漠型的特征是肿瘤实质或间质中缺乏丰富的T细胞，对ICIs治疗反应不佳[6]。最近，有研究提出将免疫评分作为表征TME免疫状态、肿瘤分类以及预测治疗反应和预后的有效指标[9]，其涉及中心和肿瘤侵袭边缘的两个淋巴细胞群（CD8+和记忆[CD45RO+]T细胞）的密度[10]。MLECNIK等[11]在599例Ⅰ～Ⅳ期结直肠癌标本中评价了免疫评分，证实其与肿瘤患者无进展生存期（progression-free survival，PFS）、总生存期（overall survival，OS）显著相关，多因素分析也显示了免疫评分在预测疾病复发和生存方面的优越性。国际上正在黑色素瘤和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）临床试验中验证免疫评分预测ICIs治疗疗效的价值[9]。

一项研究使用转录组分析对TME进行分类并证实微环境亚型可作为免疫治疗疗效预测指标[12]。研究人员首先在已发表的文献中搜索出TME各组分（如肿瘤主要成分、免疫细胞、基质细胞和其他细胞群）的功能基因表达谱特征（functional gene expression signatures，Fges）；然后构建出全面描绘TME的单一模型；接着利用肿瘤基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）、国际癌症基因组联盟（International Cancer Genome Consortium，ICGC）或基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression，GTEx）等多种数据库中的数据集对Fges分类的准确性进行验证，结果发现其具有高度细胞类型特异性，例如与正常组织和黑痣相比，肿瘤增殖特征基因的表达（包括细胞周期和肿瘤进展相关基因）与恶性黑色素瘤具有强相关性[12]；最后利用29个Fges对黑色素瘤TME进行分类并划分出以下4种微环境亚型：⑴免疫富集且纤维化（immuneenriched，fibrotic，IE/F）；⑵免疫富集，非纤维化（immune-enriched，fibrotic，IE）；⑶纤维化（fibrotic，F）；⑷免疫耗竭（immune-depleted，D）[12]。以上不同TME亚型间差异显著，与免疫治疗具有相关性，可作为潜在的预测生物标志物。例如，在抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）免疫治疗中，IE型皮肤黑色素瘤患者对治疗的应答率为82%，而F型为10%，且IE型OS最长[12]。此外，通过对免疫治疗前后进行分析，还能观察到TME对免疫治疗的动态进化。例如，接受抗PD-1治疗的黑色素瘤患者中，应答者基本为IE/F型或IE型，在治疗中保持不变或向免疫富集型环境发展；而无应答者的TMEs多为F型，在治疗中似乎维持或趋向免疫抑制性TME移动[12]。这种TME分类系统也可以解释低肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）患者免疫治疗的有效性，而且在没有TMB数据的扩大队列中，利用治疗前和治疗中的活组织检查进行TME分类仍具有很好的预测潜力。因此，TME分型和TMB分析这两种分类系统可作为免疫治疗生物标志物的相互补充。

1.2 特定微环境免疫表型

除了微环境整体免疫表型外，TME中免疫细胞或基质细胞上一些分子的表达也可表征微环境中特定的免疫表型，从而影响免疫治疗疗效，目前已作为免疫治疗预测标志物被逐步探索。最近研究发现CD28可作为免疫治疗疗效预测标志物，并以此开发新型的免疫疗法。与CTLA-4相反，CD28是一种与CD80/86相互作用而调节免疫功能的共刺激受体，能激活促进免疫反应的多种机制[13]。T淋巴细胞酪氨酸激酶（lymphocyte cell kinase，LCK）、磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）通路和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等信号通路可激活CD28，进而激活下游多种转录因子，如激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）和核因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）。这些转录因子对IL-2的产生以及T细胞的活化和存活至关重要[13]。KAMPHORST等[14]研究发现CD28信号对CD8+T细胞增殖和抗肿瘤应答的激活和恢复具有重要作用，抗PD-1治疗对CD28+细胞具有选择性增殖作用，因此建议将CD28作为预测肿瘤患者CD8+T细胞应答的潜在生物标志物。此外，PD-1被其配体PD-L1激活后，通过T细胞受体（T cell receptor，TCR）抑制信号传导。HUI等[15]通过在生化重建系统中检测PD-1信号，发现共刺激受体CD28较TCR更可能作为PD-1募集Shp2磷酸酶去磷酸化的靶标；且在完整的细胞系统中，CD28在PD-L1激活PD-1后优先去磷酸化，而不是TCR。因此认为，PD-1主要通过灭活CD28信号转导抑制T细胞功能，说明共刺激通路在调节效应T细胞（effector T cells，Teffs）功能和抗PD-L1/PD-1治疗应答中发挥关键作用。未来，通过更好地阻断PD-1与CD28结合来挽救T细胞耗竭表型可能是潜在的有效抗肿瘤免疫治疗策略。

除激活分子外，免疫细胞表面免疫检查点的表达也是特定微环境免疫表型的体现，可影响和预测免疫治疗疗效。其中，PD-1是研究较多，也是较广泛的检查点分子。有研究发现TME中效应性T细胞和调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）间PD-1表达平衡可预测PD-1阻断疗法的临床疗效[16]。该研究使用流式细胞术对TILs进行检测发现，PD-1单抗治疗有效和无效患者TME中PD-1+CD8+T细胞/PD-1+Tregs细胞的比值差异显著，其中治疗有效患者TME中具有较高的PD-1+CD8+T细胞浸润，且高表达PD-1的CD8+T细胞具有高亲和力的抗原肽；相反，治疗无效患者TME中PD-1高表达于效应Treg细胞中[16]。另一个新型的免疫检查点蛋白是T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域（T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif domain，TIGHT），其在淋巴细胞，尤其在效应CD8+T细胞和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）中高表达[17]。TIGIT可在肿瘤免疫循环的多个步骤中抑制免疫细胞，当NK细胞和T细胞表面的TIGIT与肿瘤细胞表面高表达的脊髓灰质炎病毒受体（poliovirus receptor，PVR，或称CD155）相结合时，NK细胞和T细胞的肿瘤细胞杀伤作用被抑制[17]。当阻止TIGIT与其配体结合可恢复抗肿瘤免疫功能，例如MK-7684是人源化IgG1单克隆抗体，可结合TIGIT并阻断其与配体CD112和CD155的相互作用（NCT02964013、NCT04305041）。此外，免疫细胞还可以表达其他抑制性受体，如CTLA-4、T细胞免疫球蛋白 3（T cell immunoglobulin and mucin-containing molecule 3，TIM-3）等[18]，从而导致肿瘤免疫耐药。THOMMEN等[19]研究发现，多个免疫检查点，如PD-1、TIM-3、CTLA-4和淋巴细胞激活基因-3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）的共表达增加可促进T细胞进行性严重衰竭，进一步介导ICIs耐药性的产生。综上可见，这些免疫活化分子和检查点分子的表达可能代表微环境特定免疫表型特征，不仅在预测ICIs治疗疗效中具有潜在价值，还有助于促进靶向这些分子的免疫治疗策略的开发。

2 TME免疫细胞亚群

2.1 “正性”免疫细胞亚群

不同免疫细胞亚群对ICIs治疗疗效有重要预测作用。有研究使用微滴单细胞RNA-seq（droplet singlecell RNA-seq，dscRNA-seq）和配对T细胞受体测序法测序7例患者的30 604个T细胞，以评估人膀胱肿瘤和非恶性组织的T细胞，结果发现肿瘤组织中富集有多种克隆扩增状态的细胞毒性CD4+T细胞，由表达调节或细胞毒性基因的离散细胞群组成，且这些CD4+T细胞可以主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅱ类依赖性方式杀死自体肿瘤，并被Tregs抑制[20]。该研究还发现，基因标记的细胞毒性CD4+T细胞（包括在增殖或非增殖细胞毒性CD4+T细胞中特异性上调的基因如ABCB1、APBA2、SLAMF7、GPR18和PEG10等）还能预测膀胱癌对抗PD-L1的反应，并在使用来自阿替利珠单抗治疗转移性膀胱癌的单独Ⅱ期试验（IMvigor210）中证实，该基因标记与炎症样本中抗PD-L1治疗的临床反应显著相关（P=0.037）[20]。

除CD4+T细胞外，还有研究使用单细胞mRNA测序（scRNA-seq）数据分析从而确定了黑色素瘤内的两种主要CD8+T细胞表型：记忆样和耗竭型[21]，且两者比例与ICIs治疗反应密切相关；进一步研究还发现转录因子7（transcription factor 7，TCF7）选择性表达于记忆样CD8+T细胞中，CD8+TCF7+与CD8+TCF7-TILs的比值与接受抗PD-1治疗的黑色素瘤患者的缓解率和生存期改善密切相关[21]。BALATONI等[22]研究发现TME中11种免疫细胞有7种与伊匹木单抗治疗后的OS呈正相关，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、FOXP3+T细胞、CD20+B 细胞、CD134+细胞、CD137+细胞、NKp46+细胞，且不同部位的不同免疫细胞与临床结局的相关性不同。一项涉及多种类型实体瘤组织样本的研究也表明，CD8+TILs包括组织驻留记忆T（tissueresident memory T，TRM）细胞亚群在人和小鼠的外周免疫监视和病毒免疫中发挥作用[23]。该研究发现，TRM细胞的特征性标志是表达CD103（整合素αE）且大多与CD69和/或PD-1共表达，并对患者预后及抗肿瘤免疫治疗疗效具有潜在的预测作用，其中TME携带更高水平TRM细胞的早期三阴性乳腺癌患者的预后显著改善，且对抗PD-1抗体的应答率增加[23]。最近一些研究也报道了CD8+T细胞中CD39的表达，并提示其变化或能预测ICIs治疗疗效。2018年有研究首次发现了肿瘤中一群不敏感的旁观者细胞——CD39-CD8+T细胞[24]，而在1例应用帕博利珠单抗治疗后快速免疫应答的结直肠癌患者中发现，外周血CD8+TIL CD39表达增高[24]。与此证据一致，许多研究也将CD39+CD8+TIL描述为肿瘤抗原特异性和反应性细胞[25-26]，这些功能与多种肿瘤类型（包括肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、头颈癌和胰腺癌等）中CD103共表达相关[26-28]。同样，近期一项研究发现，接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗应答人群和无应答人群中CD39+CD8+T细胞比例差异显著（28%vs7%，OR=1.250，95%CI：1.044～1.505，P=0.016），且基于mIHC多色荧光分析的CD39+CD8+T细胞比例可有效区分患者免疫治疗反应，应答组客观缓解率（objective response rate，ORR）为63.6%，无应答组ORR为0[29]。因此，CD39+CD8+T细胞亚群比例可能作为预测PD-1/PD-L1抑制剂疗效的潜在生物标志物，但目前研究证据尚不完全一致，其作用需进一步研究明确。此外，有研究通过单细胞测序探索T细胞亚克隆及其在肺癌中的作用，发现新抗原负荷与CD45RO+细胞有关，而与CD3+T细胞和CD8+T细胞密度无关[30]。因此认为，CD45RO+细胞可能是预测ICIs治疗疗效的潜在细胞亚群。

2.2 “负性”免疫细胞亚群

除效应免疫细胞外，TME中还存在多种免疫抑制细胞，如Tregs、肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）、髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）等，它们可以通过表达抑制性受体或分泌免疫抑制细胞因子抑制效应免疫细胞增殖、浸润和活化，从而促进肿瘤免疫逃逸，进而促使肿瘤进展和转移[31-32]。Tregs是控制自身免疫反应的免疫抑制细胞，可通过多种机制抑制Teffs的活化和增殖，如抑制抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）表面的MHC分子和共刺激分子（CD80和CD86）、抑制APC成熟，以及减弱其与T细胞的相互作用等[33]。Tregs还可通过分泌穿孔素和颗粒酶直接杀伤T细胞和APC，通过分泌抑制性细胞因子，如生长转化因子-β（transforming growth factor，TGF-β）、白细胞介素（interleukin，IL）-10、IL-35和耗竭γc细胞因子而抑制T细胞的活化和增殖[34]。本课题组先前研究发现，CD8+CD28-T细胞代表了一群特异性调节性T细胞，对效应T细胞增殖和细胞毒性有抑制作用；且其绝对计数降低是PFS（6.6个月vs4.1个月，HR=3.17，P=0.0038）和OS（29.4个月vs9.6个月，HR=3.05，P=0.03）改善的独立因素[35]。因此，CD8+CD28-调节性T细胞作为一种“负性”免疫细胞亚群值得进一步探索。MDSCs是一类具有强效免疫抑制活性的髓系来源细胞，也是一类调节性细胞，可通过产生免疫抑制代谢产物（活性氮氧化物中间体）、免疫抑制性细胞因子（如TGF-β、IL-10）、免疫活性酶[如精氨酸酶（arginase，ARG）、吲哚胺2，3双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）、氨肽酶]和免疫抑制性前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等[36]，促进免疫逃逸、细胞生长、血管生成及侵袭和转移，从而促进肿瘤进展[37]。有研究报道，MDSCs是头颈癌局部免疫抑制的主要促成因素，可导致患者对ICIs耐药，而限制MDSCs功能是增强患者对CTLA-4抑制剂反应的合理策略[38]。还有研究报道，高肿瘤内髓系标志物与肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）抗PD-L1治疗后中位PFS降低相关，证实了髓系细胞对ICIs的抑制作用[39]。由于集落刺激因子1（colony-stimulating factor 1，CSF-1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）与趋化因子CCL2、CCL5等的作用，TAMs在肿瘤细胞周围大量浸润[40]，可通过过表达PD-L1、TGF-β等抑制T细胞的抗肿瘤反应，并通过表达趋化因子CCL22促进Tregs细胞积累[41]。在黑色素瘤队列中也报告了TAMs与抗PD-1应答较差的相关性[42]。

此外，还有研究使用多参数流式细胞术对188例ICIs治疗的黑色素瘤患者进行了免疫谱分析，结果发现治疗后LAG-3+免疫型黑色素瘤患者的结局较差，中位OS为22.2个月，LAG-3-免疫型黑色素瘤患者中位OS为75.8个月（P=0.031）[43]。与已知临床预后标志物PD-L1和TMB相比，LAG-3+免疫型是预测ICIs治疗疗效和患者临床结局的独立标志物[43]。该研究虽是血液样本，但可能代表了这类免疫细胞亚群对免疫治疗的预测作用，需在未来研究中验证。总之，TME中的免疫细胞亚群类型对ICIs应答有重要影响，在预测生物标志物开发方面显示出广阔前景。

3 TME免疫组库的多样性

有效的T细胞应答涉及特异性抗原反应性T细胞克隆的活化和扩增，因此微环境免疫组库（immune repertoire，IR）的多样性可能与ICIs应答相关。IR是指在任何给定时间，一个个体循环系统中具有功能多样性B细胞和T细胞的总和[44]。IR可量化为丰富度和克隆性这两个指标[45]。目前关于IR的研究结果仍有争议，有研究发现TILs的克隆性与治疗前[46]或治疗后[47]对ICIs的反应呈正相关。但也有研究显示，仅治疗期间TILs克隆性增加与抗PD-1反应相关[45，48]；还有研究报道，肿瘤内T细胞克隆性与免疫治疗胰腺导管腺癌患者生存期无关，而外周T细胞克隆性与PFS和OS呈负相关[49]。TUMEH等[8]进一步研究了基线TILs TCR库的范围，并重点关注其与肿瘤特异性免疫应答的相关性，结果发现与基线和给药后活检的TCR克隆性比较，有肿瘤特异性反应的患者样本在抗PD-1治疗后扩增的克隆是前者的10倍以上。值得注意的是，基线TCR克隆性与TILs密度并不高度相关，说明一些具有肿瘤抗原特异性的限制性TCR克隆性患者即使TILs密度较低，仍可能从抗PD-1治疗中获益。考虑到难以分选肿瘤组织中的PD-1+CD8+T细胞，一项基于两个独立的患者队列的研究证实，TCR库多样性和外周PD-1+CD8+T细胞的克隆性可作为NSCLC患者ICIs治疗后临床结局的非侵入性预测因子[50]。采用IR测序（IR-Seq）5′RACE或多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法扩增TCR或B细胞受体（B cell receptor，TCR）的互补决定区（complementarity-determining region，CDR），然后进行高通量测序，可用于研究免疫系统的多样性及免疫库与疾病之间的相关性，例如追踪重排T细胞克隆的进化并预测患者疗效。总之，TME免疫组库多样性作为ICIs治疗疗效标志物的观点有待在更大规模患者群中验证。

4 TME炎症基因表达谱

炎症基因表达特征可提供比单个分子更加全面立体的TME信息，从而有效预测免疫治疗疗效。通过免疫基因表达谱更广泛地评估TME内主动免疫应答能有效地预测ICIs策略的临床获益。有研究显示，包含外周血T细胞特征基因（包括HLA-DOA、GPR18和STAT1）及肿瘤相关巨噬细胞M1特征基因（包括CBLB、CCR7、CD27、CD48、FOXO1、FYB、HLA-B、HLA-G、IFIH1、IKZF4、LAMP3、NFKBIA、SAMHD1）的基因表达谱在预测NSCLC持久临床获益和PFS方面显示出良好的敏感性和特异性，其预测性能优于已知生物标志物[51]。在Ⅱ期临床试验中，在治疗开始前和治疗开始后3周，对45例黑色素瘤患者采集的肿瘤活检组织进行基因表达谱分析，发现对伊匹木单抗有反应的患者中22个免疫相关基因的表达至少增加2.5倍，包括细胞毒性T细胞标志物（如CD8A、穿孔素1、颗粒酶B）、Th1细胞因子或趋化因子、MHC-Ⅱ及其他免疫相关基因（如NKG7、IDO1）[52]。ASCIERTO 等[53]在治疗后1～5年的复发性乳腺癌患者和7年以上无复发的患者中筛选了多个免疫相关基因，发现5个基因（IGK、GBP1、STAT1、IGLL5和OCLN）在无复发生存患者中高度过表达。还有研究建立了由40个基因（4个10-gene signature）组成的TIL特征评分，这4个基因标记分别被用于评估淋系、髓系、基质和肿瘤细胞含量，且发现TIL评分和淋巴特征评分均与免疫治疗的缓解率相关，将淋巴标志物或TIL与TMB结合，得到的评分在预测免疫治疗反应方面更高效[54]。一项涉及20种肿瘤包含313例患者的回顾性研究分析了PD-1抑制剂疗效与患者肿瘤炎症基因特征的相关性，根据18个炎症基因的表达情况，基于相关算法计算GEPs评分，发现GEPs评分高的患者亚组ORR更高，PFS更长[55]。此外，干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）诱导的免疫基因标签可能是预测ICIs治疗临床获益的有效生物标志物。有研究结合基于10个基因标签的多个免疫变量开发了IFN-γ评分，并在62例黑色素瘤患者中扩展到28个基因标记，包括编码IFN-γ、颗粒酶A/B、穿孔素1、IDO1和其他免疫相关基因，两种基因评分均显示与最佳总缓解率和PFS显著相关；而基于受试者工作特征曲线优化的IFN-γ评分临界值对应答者的阳性预测值为59%，对非应答者的阴性预测值为90%[56]。

除炎症基因表达谱外，研究者也揭示了与先天免疫治疗耐药相关的基因表达谱，这些基因同样有助于预测免疫治疗疗效。BU等[57]研究显示，在接受抗PD-1治疗的无反应黑色素瘤患者中，与伤口愈合、血管生成、缺氧、TGF-β信号传导、上皮间质转化以及细胞黏附和细胞外基质组织相关的基因集表达上调，且无应答肿瘤中表达的E-cadherin基因（又称CDH1基因）较应答肿瘤少；该研究基于此总结了先天PD-1耐药基因标记（innate PD-1 resistance，IPRES）的关键特征，即上皮间质转化相关基因表达上调（AXL、ROR2、WNT5A、LOXL2、TWIST2、TAGLN、FAP）、VEGF通路基因表达上调（IL10、VEGFA、VEGFC）、巨噬细胞趋化性基因表达上调（CCL2、CCL7、CCL8及CCL13）[57]。而这些IPRES可能对预测免疫治疗疗效不佳有潜在作用。但值得注意的是，该研究同时也显示超过30%表达IPRES标记的黑色素瘤患者对CTLA-4阻断剂（易普利姆玛单抗）有反应，表明IPRES标记并不预示对每种免疫治疗都有耐药性[57]。因此，设计靶向IPRES标记免疫逃逸特征的PD-1联合疗法可能是克服多种肿瘤类型对PD-1单药治疗耐药的方法，有望为更多患者带来肿瘤免疫治疗临床获益。

5 肿瘤和微环境免疫预测标志物联合检测

有研究[58]收集1 000多例接受ICIs治疗的肿瘤样本，对肿瘤和微环境中的T细胞进行全外显子组和转录组测序分析，以验证可用于预测ICIs治疗效果的生物标志物。该研究结果显示，在免疫浸润标志物中，CXC 趋化因子配体 9[chemokine（C-X-C motif）ligand 9，CXCL9]是最强的预测因子，其次是CD8A、T细胞炎症GEPs和PD-L1；对CD8+肿瘤浸润淋巴细胞单细胞RNA的测序结果显示，CCR5和CXCL13是ICIs治疗疗效敏感的预测因子[58]。尽管目前已鉴定出了多个预测因子，但对ICIs治疗临床反应的数据表明，任何单一预测生物标志物均存在局限性，不能有效识别获益人群。而利用联合检测或建立有效预测模型可能提高预测灵敏度，并有效捕获肿瘤患者的免疫状态。肿瘤和微环境相依相行、相互作用并共同影响免疫治疗疗效反应。因此，联合检测肿瘤和微环境标志物可能提高预测肿瘤对ICIs治疗应答的准确性。YU等[59]研究发现，与 CD8+TILs、PD-L1和TMB三种预测标志物中任一种或任两种生物标志物相比，三者复合变量与OS和PFS改善相关。也有研究采用多平台免疫基因组分析转移性尿路上皮癌肿瘤组织，发现对ICIs应答良好的患者，肿瘤细胞中AT丰富结构域1A基因（AT-rich interactive domain 1A，ARID1A）突变及肿瘤周围免疫细胞中免疫细胞因子CXCL13表达较为丰富，随后在两个独立的验证队列（CheckMate275和IMvigor210）中证实两者联合能作为预测ICIs治疗反应生物标志物时也显示出更显著的OS改善[60]，说明了开发既考虑肿瘤细胞因素又考虑微环境免疫细胞因素的组合生物标志物的重要性。同样，一项涵盖22种癌症类型包含超过300例患者的4项临床试验也证实TMB和T细胞炎性GEPs在识别PD-1抗体应答和无应答者方面具有联合预测效用，显示了同时捕获新抗原性和T细胞活化的独特特征[61]。

多组学联合分析也有助于提高预测标志物的准确性。有研究结合微环境免疫因子与放射组学开发了CD8细胞的放射组学特征评分，并通过TCGA数据集中CD8细胞的基因表达标记进行验证[62]。该研究显示，在假定免疫表型的队列中，这一标记能够区分炎性肿瘤和免疫沙漠肿瘤（P＜0.0001）；其中在接受抗PD-1/PD-L1治疗患者中，较高的基线放射学评分（相对于中位数）与3个月和6个月时达ORR患者比例较高相关，多因素分析也显示高基线放射组学评分与OS改善显著相关（P=0.0022）[62]。可见，CD8细胞的放射组学特征在3个独立的队列中均得到验证，因此该成像预测因子为预测肿瘤的免疫表型和接受抗PD-1/PD-L1治疗患者临床结局提供了一种有前景的方法。JIANG等[63]设计了一种全新的计算架构——肿瘤免疫功能障碍和排斥评分（tumor immune dysfunction and exclusion，TIDE），该评分主要结合TMB、PD-L1水平和IFN-γ。该研究通过对TCGA和PRECOG（基因组图谱预测临床结局）数据库进行分析（n=33 197），揭示了不同免疫细胞类型肿瘤浸润水平对患者OS的影响，同时证实TIDE评分较既往单一生物标志物能够更好地评估抗PD-1和抗CTLA-4的治疗疗效，是已有候选生物标志物中ICIs治疗疗效的最佳预测因子[63]。总之，多个独立预测标志物的联合检测不仅可以扩大受益人群，而且对于相互作用的标志物，还可以根据每个因素的不同影响权重建立基于生物信息学的预测模型，以综合评估，提高筛查受益人群的准确性。此外，如何更好地利用各种标志物的相互关系网络，并达到最佳成本效益，是构建综合预测模型时需考虑的问题。未来，通过大样本分析肿瘤和微环境免疫特征，利用机器学习和人工智能构建多变量模型进行免疫治疗疗效预测，将有助于构建肿瘤精准治疗新模式。

6 小结与展望

近年来，ICIs疗效预测标志物的开发从肿瘤细胞内的分子逐渐拓展到TME中各种分子和细胞，人们也进一步认识到TME中免疫和炎症因素对ICIs治疗应答的关键作用。从TIME角度出发，对ICIs疗效预测生物标志物的探索有助于阐明免疫系统网络调控与肿瘤间存在的复杂相互作用，更全面地反映ICIs治疗对肿瘤影响的复杂性和多样性。未来，随着多重免疫组化染色、高通量测序、微阵列等高新技术研究的发展，越来越多的潜在微环境生物标志物将可在基因组规模上被广泛筛选，多种蛋白质和细胞群也可被量化。但是，关于TME标志物的探索仍存在诸多挑战。首先，目前研究多为探索性、回顾性研究数据，缺乏前瞻性研究验证，如何有效应用于临床实践还存在挑战；然后，对单一生物标志物的认知有待进一步增强，标准化标志物精准检测平台亟需探索；最后，鉴于各种新型生物标志物的出现及单一标志物的局限性，结合肿瘤、TME及宿主等多方面因素建立复合预测模型以全面捕获机体免疫状态可能是提高ICIs疗效预测的有效策略。目前，使用机器深度学习和人工智能探索ICIs治疗疗效和耐药性生物标志物已逐步走向临床实践。未来，随着对这些生物标志物研究的深入和数据的积累，有望建立更完整的预测体系，从而在分子定义的患者队列中加强免疫监测和疾病控制。