弥漫大B细胞淋巴瘤分型研究进展

李喆 岑洪

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院淋巴血液儿童肿瘤内科

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）占所有非霍奇金淋巴瘤的25%～35%，是一组具有不同临床、病理和生物学特征的异质性、侵袭性淋巴瘤[1]。既往临床研究确定了利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松（R-CHOP）作为DLBCL患者的一线标准治疗方案，其中50%～70%的患者可以治愈[2-4]，但是也有很大一部分患者表现为难治或完全缓解后复发[5]，而只有10%的难治复发患者可以通过传统的挽救免疫化疗联合自体造血干细胞移植治愈[6-7]，其余90%的患者治疗结局不佳。因此，如何改善这部分患者的预后成为面临的巨大挑战。目前临床上也有研究探讨在R-CHOP基础上联合其他药物（如联合来那度胺、伊布替尼等）来进一步提高疗效，但未取得明显进展。DLBCL具有显著异质性，因此如何进行精确分层诊断以及指导个体化治疗也是目前的研究热点之一。本文就DLBCL分型的进展进行总结。

1 利用基因表达谱芯片进行DLBCL的COO分型

DLBCL在细胞形态和预后上呈明显异质性，2000年，ALIZADEH等[8]应用基因芯片技术筛选出在淋巴细胞发育分化及致癌过程中起重要作用的3 186个基因并进行检测，绘制了DLBCL基因表达谱（gene expression profile，GEP），发现DLBCL起源于不同分化阶段的B淋巴细胞。而根据GEP可以将DLBCL分为生发中心样（germinal center B cell like，GCB）型和活动B细胞样（activated B cell like，ABC）型两种亚型。随后ROSENWALD等[9]研究也证实了这一结果。后续有研究通过纳入更多病例和更多种类的基因筛选，发现部分患者无法确定细胞来源，其特征界于两种亚型之间，被命名为第3型，亦称为未分类型[10-11]。而对于不同起源的DLBCL，研究发现其显示出不同的预后，其中GCB来源的DLBCL可以获得更长的生存时间[12]。细胞起源（COO）分型揭示了DLBCL的异质性，在R-CHOP治疗下，各亚型间具有显著的生存差异，为评估预后和方案选择奠定理论依据。基于基因芯片技术的GEP检测结果目前被公认为判断DLBCL细胞起源的金标准，检测结果最可靠，但费用昂贵，对标本要求高，通常需要新鲜冰冻的活体组织标本，因此可操作性不强，临床并未广泛采用。

2 利用NanoString技术进行DLBCL的COO分型

NanoString（荧光条形码标记的单分子检测）是一种全新的高通量检测基因表达谱技术，基于核酸分子与探针杂交后，对探针上的荧光分子条形码进行直接测量。每个条形码标记对应某一特异mRNA序列，在同一样本中最高可以测量800个条形码，而所需的样本量可以低至100 ng RNA。NanoString的数字化定量技术无需转录、扩增或者文库构建，省去了冗长的实验程序和人力资源，也最大程度地降低了由酶促反应带来的潜在偏差[13]。对于样本量稀少的临床样本，NanoString技术可以不经过RNA提取，直接利用石蜡包埋样本对RNA进行定量，这种技术优势使其在临床上具有更好的实用性。SCOTT等[14]根据GEP分型的数据筛选出20个基因，采用NanoString技术对119例DLBCL样本进行COO分型，研究结果与“金标准”的一致性达到95%，也可以将患者分为GCB型、ABC型和未分类型，后两者统称为non-GCB型，其中同样显示GCB型预后优于non-GCB型。其他基于NanoString技术进行的研究也进一步证实了该技术在DLBCL的COO分型中的价值[15-17]。

3 利用定量PCR技术进行DLBCL的COO分型

基因芯片分型和NanoString分型都需要昂贵的特殊仪器设备，难以在临床上广泛推广应用。定量PCR是用于验证基因表达量的常用方法，具有操作简单、灵敏度和精确度高，可从石蜡包埋获取标本等特点。李小秋团队首次采用定量PCR的方法在中国患者人群中进行大规模的临床验证，开发了一款适用于临床开展基因检测的产品，即 DLBCL-COO Assay[18]。该研究通过公共数据库中筛选32个与DLBCL-COO分型显著相关的基因，入组160例患者，然后采用免疫组化、定量PCR和基因芯片的方法分别检测其石蜡包埋标本及相应的新鲜组织标本，结果显示DLBCLCOO Assay分型结果与“金标准”一致性达到92%；生存分析显示DLBCL-COO Assay的分型结果与总生存显著相关，GCB型预后显著优于ABC型（P=0.023），与国内外研究[12]结果高度一致。相对而言，利用定量PCR技术进行分型的方法平台更开放，操作更简单，适用于广大分子病理实验室常规开展。

4 利用免疫组化技术进行DLBCL的COO分型

对于一些资金和技术比较匮乏的地区，基于GEP的分型技术难以广泛应用，因此目前临床上使用最广泛的仍是基于免疫组化（immunohistochemistry，IHC）的分型方法。2005年，HANS等[19]应用组织芯片技术进行分型，通过检测CD10、BCL6、MUM-1建立了IHC的分型模式，可以将DLBCL分为GCB型和non-GCB型，前者预后显著优于后者（P＜0.001），该分型方法与金标准的一致性为84%。为进一步提高预后判断的准确性，后续又相继提出了新的型分型系统，如Choi、Tally等。

Choi分型基于 CD10、BCL6、MUM-1、FOXP1和GCET1等5种生物标志建立，在Hans分型法基础上增加了FOXP1和GCET1两种标志物，与“金标准”的一致性达93%[20]。既往研究显示FOXP1在ABC型中高表达[21]，且高表达与不良预后相关[22]，当FOXP1取临界值为80%时可以特异性地区分ABC型DLBCL[20]。而GCET1高度局限表达于生发中心来源的B细胞，因此在Hans分型基础上加入GCET1有助于鉴别GCB型和 ABC 型的 DLBCL[23-24]。在预测预后方面，采用Choi分型预测患者3年生存率，其中GCB型为88%，ABC型为44%，与“金标准”GEP分型的预测结果（GCB型为92%，ABC型为44%）相当接近[20]。李敏等[25]对比Choi分型与Hans分型的预测能力，同样显示前者更精确，其中Hans分型下GCB组和non-GCB组患者的总生存表现为无明显差异（P=0.102），而Choi分型中GCB组预后表现明显优于non-GCB组（3年生存率分别为61.8%和42.5%，P＜0.05）。然而值得注意的是，近年来随着不同研究中心发现BCL6具有高度不一致性，因此在Choi和Hans的改良分型中都取消纳入BCL6，结果显示两者的预测效能有所减弱，但更易于临床操作和结果判读[26-27]。

如前所述可知，基于IHC的Hans分型和Choi分型具有相似的功能，对若干个抗体的结果按一定的顺序进行判断，导致某些抗体比其他抗体具有更高的优先级，这些分型方法允许在满足前面条件的情况下排除后面的抗体结果。然而，GEP分型并不按照一定的顺序或排除某些结果，为了减少这类分歧，MEYER等[26]开发了一种不按照特定顺序对抗体结果进行判断的分型方法，即Tally分型法，其与“金标准”的一致性最高，为93%，而Hans和Choi分型法均为87%。Tally分型法包括等量的GCB（GCET1和CD10）和ABC（FOXP1和MUM-1）抗体，分类由抗原阳性较多的免疫表型对决定。每种类型都使用两种抗体，因此在每种类型阳性结果相同的情况下，需要用LMO2确定免疫表型（LMO2≥30%为临界值）。已有研究证实LMO2在GCB来源的B淋巴细胞或淋巴瘤特异性表达，且其高表达与DLBCL预后良好显著相关[28]。

综上认为，基于IHC的DLBCL的COO分型方法虽然不如NanoString分型和定量PCR分型，但与“金标准”的一致性也达到74%～93%[26]，具有操作简单、价格便宜和对标本要求不高等优点，便于各医院常规开展。其中Choi和Tally分型法与“金标准”的一致性更高，但是GCET1、FOXP1和LMO2不是常备抗体，一定程度上限制了广泛应用。

5 基于基因突变的DLBCL分型探索

几乎所有的DLBCL患者均存在基因突变，具有某些突变的患者，特定的靶向药物疗效可能受影响从而影响预后。因此，基于突变特征的DLBCL亚型分析具有临床实用价值。SCHMITZ等[29]选取了574例DLBCL患者的新鲜冰冻标本，采用外显子和转录组测序，对基因芯片的DNA拷贝数进行分析，其中选取372个基因进行靶向扩增重测序，以识别具有重现性突变的基因。研究结果将DLBCL分为4个基因型：MCD型（主要为MYD88L265P和CD79B共突变）、BN2型（主要为BCL6融合和NOTCH2突变）、N1型（主要为NOTCH1突变）和EZB型（主要为EZH2突变和BCL2易位），其中MCD和N1型主要为起源于ABC的患者，EZB型主要为起源于GCB的患者，BN2型在ABC型、GCB型和未分类型的患者中分别占一定比例（GCB型占19%，ABC型占41%，未分类型占40%）。该研究还发现新的基因分型能较好地判断预后，其中BN2和EZB型预后优于MCD和N1型，MCD、N1、BN2和EZB型预测5年生存率分别为26%、36%、65%、68%，多因素分析也显示新的基因分型是影响预后的独立因素，且不受IPI评分影响。该研究小组创建了LymphGen算法[30]，在此前研究基础上将DLBCL分为7个基因型，新增了A53型（伴有TP53失活）、ST2型（伴有SGK1和TET2突变）和其他不能分类，该分型方法可以明确63.1%的DLBCL基因亚型。其中ABC型中BN2亚型预后最好，GCB型中ST2亚型预后好于EZB亚型。因此认为，新的基因分型进一步揭示了DLBCL的发病机制，各亚型之间具有不同的发病机制，不同基因亚型对免疫化疗的反应也不同，而这可能影响靶向治疗的选择，但是该分型方法的最大局限性是一部分的患者无法归入任何一个亚型，有关方面值得深入研究。

CHAPUY等[31]通过对304例DLBCL患者进行全外显子测序，获取低频突变、复发突变、体细胞拷贝数变化和结构变异的相关数据，从而将患者定义为5个基因型：C1型（主要为 BCL10、TNFAIP3、UBE2A、CD70突变和BCL6易位，多为ABC来源）、C2型（存在TP53双等位基因失活，影响染色体稳定性和细胞周期，与ABC/GCB来源无关）、C3型（主要为BCL2、CREBBP2、EZH2、KMT2D、TNFRSF14突变，主要为GCB来源）、C4型（主要为SGK1、HIST1H1E、NFKBIE、BRAF和CD83突变，多为GCB来源）、C5型（主要为CD79B、MYD88L265P、ETV6、PIM1和TBL1XR1突变，多为ABC来源，原发中枢神经系统及睾丸DLBCL在此类型中常见）和C0型（缺乏明确的遗传驱动因素）。该研究还进一步分析新基因分型与预后的关系，结果显示C0、C1和C4型预后较好，而C3和C5型预后较差，其中ABC来源的患者中C1型患者预后明显优于C5型，而GCB来源的患者中C4型明显优于C3型。新的基因分型还定义了低风险的ABC型DLBCL（C1型），其细胞可能起源于滤泡外边缘区；高风险的GCB型DLBCL伴有BCL2结构变异以及PETN和表观遗传学酶的改变（C3型），而低风险的GCB型DLBCL伴有多条通路（BCR/PI3K、JAK/STAT、BRAF）激酶和多重组蛋白的改变（C4型）；与ABC/GCB起源无关的分型伴有TP53双等位基因失活，9p21.3/CDKN2A和相关基因的不稳定性（C2型）。这些DLBCL的关键遗传学特征包括突变、体细胞拷贝数变化和结构变异，而通过获取这三类遗传信息的改变可用于解释疾病和治疗结局的差异性。

LACY等[32]基于对293个基因的靶向测序分析928例DLBCL患者的基因突变特征，将患者分为5个亚型：MYD88型（以MYD88L265P、PIM1、CD79B突变为主，主要为ABC来源，多数原发中枢神经系统、睾丸和乳腺的DLBCL患者属于此亚型）；BCL2型（以EZH2、BCL2、CREBBP、TNFRSF14、KMT2D和MEF2B的突变为主，主要为GCB来源，部分高级别淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤转化的DLBCL患者属于此型）；SOCS1/SGK1型（主要包括SOCS1、CD83、SGK1、NFKBIA、HIST1H1E和STAT3突变，以GCB来源为主，多数原发纵膈DLBCL属于此型）；TET2/SGK1型（主要包括TET2、SGK1、KLHL6、ZFP36L1、BRAF、MAP2K1和 KRAS突变，以GCB来源为主）；NOTCH2型（主要包括NOTCH2、BCL10、TNFAIP3、CCND3、SPEN、TMEM30A FAS 和CD70突变，由ABC、GCB和未分类来源共同组成，与边缘区淋巴瘤具有相似的特征）；未分类亚型（not elsewhere classified，NEC）。该研究分析了不同基因分型与预后的关系，结果显示MYD88型预后最差，5年生存率为42%；BCL2、SOCS1/SGK1和TET2/SGK1型预后良好，5年生存率分别为64.9%、62.5%、60.1%；而NOTCH2和NEC型的预后界于两者之间，5年生存率分别为48.1%、53.6%。

综上可见，3种分型系统既有区别，也有部分内容重叠。其中MYD88、C5和MCD型均与ABC来源相关，原发中枢神经系统和睾丸淋巴瘤多发生在这3种分型中，且预后不良。C2型以TP53突变/缺失为特征，多数预后不佳，A53对应于C2。BCL2、C3和EZB型与GCB来源相关，突变特征与滤泡性淋巴瘤相同，尽管双打击和高级别淋巴瘤好发于此型，但总体预后良好。而SOCS1/SGK1和C4型主要为GCB来源DLBCL，与原发纵膈大B细胞淋巴瘤的遗传特征相似，预后最好。但是目前的突变分型较复杂，不同研究的方法和结果不尽相同，因此未来仍需简化分析流程，进一步明确核心突变基因对预后和治疗的影响。

6 小结

基于GEP的COO分型是“金标准”，但是对标本要求高，费用昂贵，不易于临床常规开展。作为替代方案，基于NanoString、定量PCR和免疫组化技术的COO分型，虽然在标本要求、技术难度和实验费用等方面进一步优化，但预后判断准确性及指导治疗的作用与金标准相比仍有一定差距。目前研究也显示，几乎所有DLBCL患者含有基因突变，而不良的基因突变可显著影响预后，某些特定突变的靶向治疗也可能改善预后，因此基于基因突变的新分型具有重要的临床意义。基因突变分型是对COO分型的补充，解释了同一COO亚型中也存在显著异质性。但是基因突变分型不能包含所有患者，对临床预后的指导意义以及目前使用的传统药物和新型靶向药物是否能通过该分型指导治疗仍需加进一步研究证实。