铜蓝蛋白与恶性肿瘤

秦倩 秘嘉庆 冯勤梅

作者单位：030012 太原 山西医科大学第五临床医学院

恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见疾病，治疗手段主要包括手术、化疗、放疗等，此外免疫治疗、分子靶向治疗近年来快速发展并取得一定成效，为恶性肿瘤的治疗带来了曙光。为此，学者们不断探索更有效的治疗靶点，以进一步提高患者生存率。铜蓝蛋白（ceruloplasmin，Cp）又称铁氧化酶，是一种含铜的α-2球蛋白，具有氧化酶活性。Cp参与了人体内许多重要的生理活动，在调节氧化应激及铁稳态中起重要作用。Cp作为一种急性期反应蛋白，在感染、创伤、冠心病患者及妊娠妇女中表达增加[1-2]。在肿瘤中，Cp被认为是潜在的致癌因子，其中在肺癌[3]、卵巢癌[4]、肝癌[5]等多种肿瘤中异常表达，且可通过调节铁死亡、血管生成和影响肿瘤微环境而参与肿瘤生长及转移。本文就Cp与恶性肿瘤的研究进展作一综述。

1 Cp的结构及组织分布

Cp为多铜氧化酶家族的一员，含有95%以上的血浆铜[6]，其单链由1 046个氨基酸组成，是一种可结合6个铜离子的α-2球蛋白。在正常人体内，Cp主要由肝细胞合成，铜在肠道内以铜转运蛋白（Ctr1）依赖的方式吸收后经门静脉到达肝脏，而肝细胞中的ATP7B酶在跨高尔基网络转运过程中将铜离子结合到无铜Cp（即无活性Cp），进而形成有功能的Cp（即功能型Cp），并分泌到胆汁或血液中[7]。Cp除了在肝细胞中合成外，单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞也可在炎症因子的诱导下表达Cp[8]。Cp主要有两种亚型：分泌型（sCp）和膜结合型糖基磷脂酰肌醇锚定型（GPI-Cp）。sCp主要来源于肝脏，包括无活性Cp和功能型Cp两种形式，其中功能型Cp是人体内循环中Cp的主要形式，半衰期约为5.5 d，而无活性Cp半衰期约为5 h[9]。GPI-Cp通过选择性剪接sCp产生，剪接发生在外显子18的下游，sCp C末端的5个氨基酸由30个选择性氨基酸残基取代，增加糖基磷脂酰肌醇锚定性，主要在脑细胞及睾丸细胞中表达[10]。

2 Cp在恶性肿瘤进展中的作用

目前研究发现Cp在体内主要通过调节铁死亡、血管生成和影响肿瘤微环境参与肿瘤进展。铜是多种血管生成的关键介质（如碱性成纤维细胞生长因子、VEGF-A），也是肿瘤微环境成分发挥功能必需的辅助因子，而Cp可作为铜离子载体，能调节铜离子在体内的分布[11]。铁氧化是Cp的另一种重要功能，Cp可利用铜将电子转移到氧，使Fe2+氧化为Fe3+，进而与转铁蛋白（TF）结合后进入细胞，从而为细胞增殖提供充足的铁[12]。有研究发现，肿瘤细胞膜的转铁蛋白受体1（TFR1）表达增加时，铁以TF-[Fe3+]2-TFR1复合物进入细胞溶酶体，并在溶酶体酸性条件下释放出Fe3+，而Fe3+在铁还原酶STEAP3的作用下可还原为Fe2+，进而释放到细胞质，使Fe2+在细胞内蓄积，并进一步通过芬顿反应参与体内活性氧的形成，最终导致细胞发生铁死亡；此外在肺癌、肝癌、黑色素瘤等多种肿瘤细胞中发现，当肿瘤细胞中Cp表达增加，可利用铜将电子转移到氧，使Fe2+氧化为Fe3+，减少细胞内的Fe2+，进而抑制铁死亡[13]。由此可见，肿瘤细胞中Cp高表达可抑制铁死亡，进而减少肿瘤细胞死亡，促进肿瘤发展。此外，Cp还可通过缺氧诱导因子（HIF）促进血管生成。有研究显示，快速增长的肿瘤因缺氧反应性的激活由α亚单位和β亚单位组成的异二聚体-HIF的表达[14]，而介导其α亚单位降解的结构域含有特定的脯氨酸残基，可被脯氨酰羟化酶（PHD）羟基化[15]。当肿瘤细胞中Cp含量增加时，PHD的辅因子Fe2+含量下降，进而减弱PHD对HIF-α（HIF-1α和HIF-2α）羟基化作用，减少HIF降解[16]，同时HIF-1α与血管内皮生长因子（VEGF）的启动子结合，可进一步上调VEGF表达[15，17-18]，而VEGF可结合血管内皮细胞膜上的受体触发导致血管生成的酪氨酸激酶途径，从而促进血管生成[19]。

2.1 Cp与肺癌

目前的研究显示，Cp在肺癌中高表达且与患者预后不良相关，并可能通过促进血管生成导致肺癌进展，是肺癌潜在的治疗靶点及预后评估分子标志物。CHEN等[3]通过生物信息学分析141例肺腺癌患者及191例正常对照组患者，发现1 238个差异表达基因中，Cp作为一种上调表达基因在肺腺癌的发展中起作用。SUN等[20]通过表达阵列筛选敲除肺肿瘤抑制基因GPRC5A和野生型小鼠的上调基因，作为前20个上调基因之一的Cp可能参与GPRC5A缺乏的肿瘤发生，同时通过搜集数据库Oncomine中的信息发现肺癌患者中GPRC5A表达下调且Cp表达上调，推测GPRC5A可能调节Cp表达。该研究进一步通过体内外研究发现，Cp在非小细胞肺癌组织及大多数肺癌细胞系（如HCC827、H1792、H1975和H661）中呈高表达，且其在敲除肺肿瘤抑制基因GPRC5A的肺癌小鼠模型中表达增加，而GPRC5A重新表达后，Cp表达降低，提示Cp在肺癌中发挥的作用可能与GPRC5A有关。该研究还发现，Cp在GPRC5A敲除小鼠肺上皮细胞和非小细胞肺癌细胞中表达上调，但在肺癌细胞系H1299和H661中过表达GPRC5A后，Cp并未受到抑制，表明由GPRC5A缺陷引起的Cp上调表达可能发生在正常肺上皮细胞或早期肺肿瘤组织中，随着肿瘤发展，表观遗传学改变，抑制了GPRC5A过表达对Cp表达的抑制效应，Cp可能与肺肿瘤发生的过程有关。而TSAI等[16]通过转录组测序技术比较7组肺腺癌组织及正常肺组织中Cp表达情况，结果显示其中4组肺腺癌组织的Cp mRNA含量较正常肺组织增加，分析Oncomine肿瘤数据库中7个数据集亦发现在肺癌组织中Cp mRNA较正常肺组织中含量增加；进一步通过RNA测序及miRwalk 2.0网站分析，发现在肺癌中miR-145-5p（肿瘤抑制因子）与Cp mRNA的非转录区域结合，从而抑制Cp表达。还有研究报道，HIF作为Cp的靶基因，在多种肿瘤生长中起促进作用[15]。HIF-α羟基化受PHD调节，当Cp含量增加时，Fe2+含量下降，从而减弱PHD对HIF-α羟基化作用，进而增加HIF活性，上调VEGF-A表达[18]。由此推测肺腺癌细胞可能通过miR-145-5p→Cp→PHD1/2→HIF-2α→VEGF-A信号通路促进血管生成，影响肿瘤生长及转移。

关于Cp与肺癌预后的关系，TSAI等[16]分析GEO数据库中的GSE31210数据集，结果显示Ⅱ期肺癌患者癌组织中Cp的表达较Ⅰ期患者高，且其高表达与较短的生存期相关（HR=1.4，P=0.023）。MATSUOKA等[21]研究亦发现Cp与肺癌的侵袭性和预后显著相关，Cp在浸润型肺癌组织中的表达率（54.3%）明显高于微小浸润型腺癌（16.7%）和原位腺癌（0.5%）（P＜0.01），且微小浸润型腺癌高于原位腺癌（P＜0.01）；Cox回归模型分析显示Cp高表达患者的死亡风险高于低表达患者（HR=1.642，95%CI：1.050～2.568）。同时，该研究还观察到Cp不仅在癌细胞中表达，在肺泡腔中也可见染色，在肺癌细胞的培养上清中含量明显高于细胞裂解液，可能是由于肿瘤细胞产生的Cp完全分泌到培养基中，因此认为肺癌细胞表达sCp，分泌进入肿瘤微环境发挥促进血管生成及肿瘤转移的作用，导致患者预后不良。

2.2 Cp与卵巢癌

卵巢癌术后复发率较高，且复发患者易产生化疗耐药[22]，预后极差。近年来靶向治疗（如PARP抑制剂）在卵巢癌的治疗中取得了突破性进展[19]，因此不断寻找更有效的治疗靶点尤为迫切。目前研究显示Cp在卵巢癌中具有一定应用前景，如TRIFANESCU等[4]通过分光光度法分析显示Cp在卵巢癌患者血清中较正常值明显增加。腹水可作为发现卵巢癌生物标志物更好的介质，MIYAMOTO等[23]进一步利用腹水代替血清进行蛋白质组学分析，结果显示Cp在卵巢癌患者腹水中含量较对照组血清丰富，提示卵巢癌细胞可能通过分泌Cp进入腹水，发挥促卵巢癌进展的作用。DAI等[24]研究亦显示癌基因LINC00176可通过募集转录因子BCL3上调Cp表达而发挥促进细胞增殖、迁移、侵袭及抑制细胞凋亡的作用，LINC00176/BCL3/Cp轴为研究卵巢癌的发生及寻找治疗靶点提供了思路。Cp还与卵巢癌患者化疗耐药密切相关，影响患者的预后。卵巢癌患者经手术联合化疗治疗后，可使大部分患者获得完全缓解，但超过70%的晚期上皮性卵巢癌患者在疾病稳定（完全或部分缓解）后复发，常常伴有化疗耐药，随着复发次数的增加，无铂间期缩短、化疗效果变差，患者疾病进展、最终死亡。HUANG等[25]研究显示Cp在化疗敏感的卵巢癌患者腹水中的平均浓度显著低于固有化疗耐药患者（157.5 mg/mLvs192.2 mg/mL，P=0.001）。铂耐药卵巢癌患者口服降铜剂降低Cp后，可增强Ctr1功能，促进卡铂进入卵巢癌细胞，增强细胞对卡铂的敏感性，使患者对卡铂再次敏感[26]。TRIFANESCU等[4]监测35例卵巢癌患者术后4个疗程铂化疗后血清中Cp的水平，发现其平均水平由169.6 UI降低至139.0 UI。以上研究提示，较高的Cp水平与卵巢癌患者化疗耐药相关，Cp可能是卵巢癌患者预后不良和化疗耐药的预测标志物。

2.3 Cp与乳腺癌

乳腺癌具有多器官转移特性，研究表明Cp在乳腺癌转移中发挥重要作用，是阻断乳腺癌转移的潜在治疗靶点[27]。铜是肿瘤进展的必须成分，大量临床前模型研究显示铜可上调上皮间质转化基因，促进上皮间质转化，是重塑肿瘤和肺转移前微生态关键酶如赖氨酰氧化酶（LOX）、过氧化物歧化酶-1、血管黏附蛋白-1的重要组成成分；而铜缺乏可导致细胞增殖、血管形成、肿瘤增长及侵袭性下降，使肿瘤进入休眠状态[28-29]。乳腺癌转移所需的微环境也需要足够的铜参与，而Cp作为铜的主要载体，可能为肿瘤发展和转移提供有利条件。CHAN等[30]分析75例口服四硫代钼酸盐（铜螯合剂）乳腺癌患者，发现Cp水平下降至5～17 mg/dL（铜耗竭定义为Cp＜17 mg/dL）后进入维持治疗阶段，且内皮祖细胞（血管生成开关）和赖氨酰氧化酶样蛋白2等含量明显下降（P=0.002；P＜0.001）；在乳腺癌小鼠模型中发现，经四硫代钼酸盐处理后Cp水平降低的小鼠转移前肺中的LOX和胶原沉积均减少（P=0.03；P=0.01），继发性肺转移发生率亦下降（P=0.04），而补充铜含量后可挽救LOX活性，表明LOX活性的丧失可能由四硫代钼酸盐消耗铜所致，Cp可能与乳腺癌转移相关。此外，GANGODA等[27]利用TMHMM蛋白跨膜结构工具分析发现，具有高转移特性的乳腺癌细胞株的外泌体中富集的Cp是非转移细胞系的19～31倍，可见乳腺癌细胞可以分泌Cp，且Cp的含量可能反应了肿瘤进展状态。KRZYMINIEWSKI等[31]也报道Cp含量随放疗次数的增加而下降，认为Cp是监测乳腺癌患者放疗反应的潜在标志物。

2.4 Cp与消化系统肿瘤

在消化系统肿瘤中，Cp可通过调节铁死亡及血管生成参与其发生发展，因此靶向Cp的抗肿瘤药物可能成为新的治疗策略。SHANG等[5]报道在肝细胞癌细胞中抑制Cp表达可导致Fe2+在细胞内蓄积，促进细胞铁死亡；而过表达Cp则抑制肝癌细胞铁死亡，提示Cp在肝细胞癌细胞铁死亡中起关键作用，以Cp为靶点诱导铁死亡可能是肝癌新的治疗策略。在结肠癌中，DAI等[32]在体外结肠癌细胞中发现Cp表达被SARI（肿瘤生长抑制剂）抑制后，HIF-1a/VEGF轴活性及VEGF表达和血管生成随之受抑制；体内研究也发现，SARI敲除的小鼠肿瘤组织中Cp、HIF-1α、VEGF表达均较野生型小鼠增加（P＜0.01），推测SARI可能通过诱导Cp蛋白降解，抑制HIF-1α/VEGF轴活性，减少VEGF表达，从而抑制血管生成及结肠癌进展。此外，还有研究[33]通过数据分析发现胆管癌T、N分期晚期和神经侵袭性胆管癌组织中Cp表达增高（P＜0.05），且Cp高表达患者的中位生存期较Cp低表达患者短（27.5个月vs46.1个月，P=0.307）。SERBANESCU等[34]发现放化疗前直肠癌患者血清中的Cp含量较正常者高，放化疗开始时，Cp含量有所下降，但是随着放化疗进行Cp含量增加，其原因可能与治疗引起氧化应激有关。

2.5 Cp与其他恶性肿瘤

除上述肿瘤外，还有研究发现Cp与肾细胞癌和口腔恶性肿瘤的发生发展密切相关。如BLEU等[35]基于TCGA数据库分析发现Cp在肾细胞癌中过表达，且Cp高表达患者的生存率显著降低；而肾细胞癌中的PAX8（候选致癌基因）可通过控制远端增强子（如e-Cp）活性激活Cp基因表达，影响间质细胞交联及血管形成；体内外研究发现PAX8低表达时Cp表达也显著减少，可见PAX8可能通过调节靶基因Cp表达发挥致癌作用。在口腔疾病的研究中，SHAH等[36]通过半自动免疫比浊法分析口腔白斑、口腔粘膜下纤维化、烟酸口炎、口腔恶性肿瘤、吸烟或嚼槟榔但无口腔病变和健康对照组共6组患者血清中Cp的表达水平，结果显示Cp在口腔恶性肿瘤中的表达较无口腔病变组显著增加（P＜0.001），且Cp表达水平随病情加重而升高，提示Cp可能与口腔恶性肿瘤进展相关，可作为预测口腔癌前病变恶变的生物标志物。

3 小结

综上所述，Cp在多种恶性肿瘤中异常表达，可能通过调节铁死亡、血管生成和影响肿瘤微环境而参与肿瘤生长及转移，且与患者预后不良显著相关，可能是潜在的致癌因子。因此，未来以Cp靶点诱导铁死亡，抑制血管生成或者调节肿瘤微环境可能是恶性肿瘤潜在的新的治疗策略。但目前Cp在恶性肿瘤中的作用研究较少，且主要集中在动物模型及肿瘤细胞系研究，因此未来尚需更深入的探索，进一步明确其与恶性肿瘤的关系，为恶性肿瘤的诊疗及预后评估提供新的分子标志物。