脓毒症患者外周血单个核细胞中YAP mRNA表达变化及与预后的关系

李峥嵘，吴双华，谢璨灿，曾维忠

株洲市中心医院重症医学科，湖南株洲412007

危重症患者脓毒症发病率和病死率都很高[1]。目前尚无快速诊断脓毒症的方法，也没有针对脓毒症的具体治疗方法。有证据表明，早期治疗有助于改善脓毒症患者预后。因此，早期识别与尽早治疗是必要的。APACHEⅡ评分是最常用的危重脓毒症评分系统，但评分繁琐，并且需大量的变量，具有延迟性。降钙素原(PCT)对革兰阴性菌感染敏感，且受多种因素影响。乳酸(Lac)在临床上用作评估脓毒症的严重程度和预后，但缺乏特异性。所以，快速诊断脓毒症仍是挑战[2]。Yes相关蛋白(YAP)是Hippo通路中重要的转录激活因子[3-4]，其能激活对增殖分化、免疫和血管形成起重要作用的靶基因的表达[5-6]。激活YAP或失去其上游负调节剂会导致细胞过度生长和产生肿瘤表型。近年来研究者们发现YAP也能调节脓毒症引起的炎症反应。先前有学者发现，革兰阳性菌可通过Toll依赖途径激活果蝇体内的Hippo-YAP通路[7]。LV等[8]发现，内皮细胞中，YAP通过与TRAF6相互作用调节细胞的炎症反应。调控内皮细胞YAP表达可能是预防脓毒症所致炎症损伤的一种方法。已有研究者在细胞与小鼠实验中证明内毒素能诱导YAP表达上调[9-10]。本研究观察了脓毒症患者外周血单个核细胞中YAP mRNA表达变化，并探讨其与脓毒症严重程度的关系，旨在为脓毒症的早期评估及预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年11月—2019年6月株洲市中心医院重症医学科收治的脓毒症[11]患者49例纳入脓毒症组。患者给予抗感染、液体复苏治疗，必要时给予血管活性药物和机械通气辅助呼吸及各器官对症支持治疗。脓毒症组患者入院28 d内存活28例、死亡21例。排除标准：入院后24 h内死亡者或入院4 h内转出重症医学科的患者；免疫缺陷疾病、肿瘤性疾病、遗传代谢性疾病及近期使用免疫抑制剂治疗的患者；年龄<18岁或>80岁；妊娠；病历资料记录不完整者。脓毒症组男29例、女20例，年龄(65.78±19.28)岁，肺部感染20例、腹腔感染16例、泌尿系统感染6例、皮肤软组织感染4例、其他感染3例。脓毒症组存活者中，男16例、女12例，年龄(62.42±20.76)岁；死亡者中，男13例、女8例，年龄(70.24±16.54)岁。选择同期进行体检的健康成年人38例纳入对照组，男23例、女15例，年龄(59.63±13.27)岁。脓毒症组与对照组、脓毒症组内存活者与死亡者的性别、年龄资料均有可比性。本研究符合医学伦理学标准，经医院伦理委员会批准并获得患者知情同意。

1.2 外周血单个核细胞YAPmRNA检测 脓毒症组入ICU后6 h内或ICU诊断为脓毒症后6 h内使用EDTA抗凝管抽取静脉血，抽取对照组静脉血，用人外周血单个核细胞提取液(天津灏洋公司)采用密度梯度离心法提取单个核细胞。采用RT-PCR法检测两组单个核细胞中的YAP mRNA。按照TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA，测量浓度和纯度。稀释后的总RNA根据TaKaRa逆转录试剂盒使用说明书进行逆转录，得到cDNA，进行PCR反应。PCR反应体系共20 μL，包括cDNA 2 μL，灭菌水6 μL，上、下游引物各0.8 μL(YAP上游引物序列为5′-TTGGCTAGACCCAAGGCTTG-3′、下游引物序列为5′-GTTGCTGCTGGTTGGAGTTG-3′，内参GAPDH上游引物序列为5′-GATTTGGTCGTATTGGGCGC-3′、下游引物序列为5′-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC-3′)，TB Green Premix Ex Tap Ⅱ 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL。PCR扩增条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。每个样本设2个平行反应孔，采用2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。

1.3 APACHEⅡ评分、PCT、Lac水平资料收集 收集入院时PCT、Lac检查资料，以24 h内最差指标计算APACHEⅡ评分。

2 结果

2.1 两组外周血单个核细胞中YAP mRNA表达比较 脓毒症组、对照组YAP mRNA相对表达量分别为2.70±1.02、1.07±0.91；脓毒症组内，死亡者、存活者YAP mRNA相对表达量分别为3.49±0.87、2.11±0.66。脓毒症组及组内死亡者和存活者外周血单个核细胞中YAP mRNA表达均高于对照组，脓毒症组内死亡者YAP mRNA表达高于存活者(P均<0.05)。

2.2 脓毒症组死亡与存活患者APACHEⅡ评分、PCT、Lac水平比较 脓毒症组死亡者、存活者APACHEⅡ评分分别为(27.00±5.84)、(18.54±4.90)分，PCT水平分别为15.95(68.31)、7.5(92.3)ng/mL，Lac水平分别为(5.98±4.76)、(2.74±2.23)mmol/L。脓毒症组死亡者APACHEⅡ评分、Lac水平高于存活者(P均<0.05)。

2.3 脓毒症组外周血单个核细胞中YAP mRNA表达与APACHEⅡ评分、PCT、Lac水平的相关性 脓毒症组外周血单个核细胞中YAP mRNA表达与APACHEⅡ评分呈正相关(r=0.982，P<0.05)，与PCT、Lac水平无明显相关性(r分别为0.025、0.348，P均>0.05)。

2.4 YAP mRNA、APACHEⅡ评分、Lac水平对脓毒症患者预后的预测价值 由表1、图1可见，与APACHEⅡ评分、Lac水平相比，YAP mRNA表达预测脓毒症患者预后的灵敏度、特异度、ROC曲线下面积(AUC)更高。

表1 YAP mRNA、APACHEⅡ评分、Lac水平预测脓毒症患者预后的效能

图1 YAP mRNA、APACHEⅡ评分、Lac水平预测脓毒症患者预后的ROC曲线

3 讨论

当机体受到病原体入侵后，外周血单个核细胞接受信号刺激，通过Hippo信号上游通路整合，YAP去磷酸化积聚于细胞核进而调控基因表达，参与细胞增殖、细胞分化及细胞因子的生成。在脓毒症中，巨噬细胞向M1型分化，YAP调控炎症因子表达并促使炎症因子向外周血大量释放，促发全身炎症反应，引起多器官功能发生障碍，导致感染加重和脓毒症休克的发生[8]。有学者发现，YAP通过与TRAF6的直接相互作用，调节内皮细胞中NF-κB的激活。YAP通过K48泛素诱导TRAF6降解，同时抑制K63连接的自动泛素化，以防止TAK1复合物和NF-κB下游信号的形成与激活。上述研究结果指明了内皮细胞YAP与NF-κB信号转导抑制之间的重要功能联系，以及YAP在限制内皮细胞活化中的作用，提示YAP是内皮活化和炎症的调节因素。这为预防脓毒症引起的组织炎症反应和器官功能衰竭提供了新方向。

SONG等[12]在非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中发现YAP在肝脏组织中表达增高，而且肝巨噬细胞中的YAP通过上调促炎细胞因子表达而加重肝脏炎症。进一步机制研究表明，内毒素可激活肝巨噬细胞中YAP的表达，YAP通过调控炎症因子转录，诱导促炎细胞因子表达。在非酒精性脂肪性肝炎中，肠道微生物产生的脂多糖激活肝巨噬细胞，导致促炎细胞因子分泌而加重肝脏炎症反应。TLR4信号通路与Hippo-YAP信号通路之间存在一种新的串扰，即TLR4通过转录激活肝巨噬细胞中的YAP加重肝脏组织的炎症反应，这丰富了内毒素在非酒精性脂肪性肝炎中介导炎症反应的机制。抑制YAP可能是治疗非酒精性脂肪性肝炎的新策略。

脓毒症所致急性肺损伤的特点是肺微血管内皮细胞凋亡。LEI等[13]通过脓毒症小鼠模型探讨内毒素诱导肺微血管内皮细胞凋亡的分子机制，发现内毒素激活YAP在细胞核内聚集，并与转录因子p73结合来诱导血管内皮细胞凋亡。干扰YAP的表达不仅能阻止内毒素诱导的内皮细胞凋亡，而且还能阻断内毒素刺激内皮细胞中p73的激活。他们报道了YAP/p73信号在内毒素诱导的内皮细胞凋亡中的核心作用。脓毒症相关急性肺损伤还伴随着大量促炎因子和凝血功能紊乱，组织因子依赖的凝血激活导致凝血酶形成和纤维蛋白在肺微血管中沉积，进一步加剧急性肺损伤。有学者[14]用内毒素刺激血管内皮细胞，发现YAP表达上调，YAP体内干扰剂气管内注射有助于减轻脓毒症小鼠急性肺损伤。

脓毒症患者外周血中的病原体产物及炎症介质刺激单个核细胞，促进单个核细胞内YAP基因的转录与表达，导致YAP合成增多。YAP向细胞核内易位，通过与转录模块结合，促进炎症因子表达。在脓毒症病理状态下，YAP的激活可能形成了一个正反馈环，从而降低YAP的降解并诱导其合成增加，进一步上调炎症因子表达，引发脓毒症炎症的级联反应。本研究观察了脓毒症患者外周血单个核细胞中YAP mRNA表达变化，结果显示，脓毒症组及组内死亡者和存活者外周血单个核细胞中YAP mRNA表达均高于对照组，脓毒症组内死亡者YAP mRNA表达高于存活者。左文等[9]构建脓毒症细胞模型，发现巨噬细胞向M1型分化后会向外周血分泌大量炎症因子，细胞中去磷酸化YAP表达增高、磷酸化YAP表达降低，推测去磷酸化YAP可能与脓毒症的发生发展有关。LV等[8]发现，内毒素刺激后的内皮细胞中YAP表达增高，敲除内皮细胞中YAP基因表达后细胞培养上清液中炎症因子浓度升高，而YAP过表达时细胞培养上清液中的炎症因子浓度降低，考虑YAP可能与炎症因子的表达存在关联。本研究结果与上述研究一致，表明YAP参与脓毒症的发病，并与严重程度有关。

APACHEⅡ评分是最常用的评估疾病严重程度并预测危重患者临床结局的评分系统，对预测脓毒症预后有一定价值，分值越高则脓毒症患者死亡风险越大[15-18]。PCT水平升高能反映全身炎症反应加重。但PCT水平会受到创伤、手术、致病菌种类以及药物的影响。有学者共识指出，PCT的初始值对脓毒症预后的评估意义有限，不能凭借单一指标及某个时间点的指标预测脓毒症的预后[16]。血清Lac水平通常被纳入危重疾病的临床管理，特别是脓毒症患者[17]。Lac与脓毒症病情严重程度及预后相关。高水平的Lac可能是患者死亡的预测指标，治疗过程中Lac水平降低也与临床结局的改善有关[19-20]。本研究结果显示，脓毒症组死亡者APACHEⅡ评分、Lac水平高于存活者，而两者PCT水平差异无统计学意义。在脓毒症组中，YAP mRNA表达与APACHEⅡ评分呈正相关，而与PCT、Lac水平无明显相关性。进一步评估YAP mRNA、APACHEⅡ评分、Lac水平对脓毒症患者预后的预测价值，结果显示，与APACHEⅡ评分、Lac水平相比，YAP mRNA表达预测脓毒症患者预后的灵敏度、特异度、AUC更高。这提示YAP mRNA表达水平可能有助于预测脓毒症患者的临床结局，是评估脓毒症患者预后的潜在指标。

综上所述，脓毒症患者外周血单个核细胞中YAP mRNA表达升高，且死亡患者高于存活患者，YAP mRNA表达与APACHEⅡ评分有关；YAP mRNA检测有助于预测脓毒症患者的预后。本研究也存在不足之处。本研究样本量较少，下一步可扩大研究，更有力地说明脓毒症患者外周血单个核细胞YAP表达水平与病情严重程度的关系。此外，脓毒症病情易受多种因素干扰，本研究与相关研究结论也有所差异。虽然上述结果存在一定局限性，但是外周血单个核细胞YAP基因检测为脓毒症的诊断及病情评估提供了一个新思路。可以设想YAP mRNA检测能有利于脓毒症的早期识别、早期评估、预后判断及远期风险评估，以提高临床对脓毒症患者的管理和治疗水平，并指导医疗资源的最佳配置。