基于质谱的蛋白质组学技术在泌尿生殖系统肿瘤标记物检测中的研究进展

逄瑷博，李博安 综述 田亚平 审校

泌尿生殖道癌是最常见的癌症之一，包括膀胱癌、肾癌、前列腺癌等[1]。其中膀胱癌占所有新发癌症的3%，占所有癌症死亡人数的2%，男性的发病率是女性的3.4倍[2]。肾癌的发病率低于2%，但男性的发病率是女性的1.7倍，占所有癌症死亡人数的2%[3]。前列腺癌是仅次于肺癌(占总数的14%)的第二大男性恶性肿瘤，是男性癌症死亡的第四大原因，仅次于肺癌、肝癌、胃癌和结直肠癌[4]。

泌尿生殖道癌具有高发病率和死亡率，但早期诊断和治疗可改善患者的预后。癌症的发生与发展是非常复杂的过程，在一定程度上反映了患者之间的异质性。尽管人类基因组计划绘制了人类基因的图谱，但对于大多数癌症来说，仅使用基因组数据仍然不能预测癌症的进展和药物治疗疗效。基因的核苷酸序列被翻译成具有多种功能的蛋白质，包括催化代谢反应、执行DNA复制以及介导细胞对外部刺激的反应等，因此，表达蛋白的种类与数量可反映细胞的特性，使蛋白质组学技术成为肿瘤研究的重要工具之一。这些技术可以分析功能蛋白并检测其在临床样本中的表达，对于监测肿瘤发生和发展过程中特定蛋白表达的变化具有重要的临床意义，蛋白质组学也为肿瘤诊断、治疗和其他临床应用的潜在生物标记物研究提供了一种新方法[5]。质谱是蛋白质组学的重要分析方法，通常与液相色谱、气相色谱、离子迁移率和毛细管电泳等分离技术相结合，以提高峰容量，从而改善复杂生物体系样品的分离、分析及检测[6]。笔者介绍基于质谱的蛋白质组学技术在膀胱癌、肾癌、前列腺癌肿瘤标志物检测中的研究进展。

1 膀胱癌标志物

对于膀胱癌的诊断，研究显示载脂蛋白A1(apolipoprotein A1，APO A1)是一个潜在的生物标记物。临床研究显示，尿液样本通过酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测APO A1对膀胱癌诊断的总敏感性和特异性分别为94.6%和92.0%，曲线下面积(area under the curve，AUC值)为0.982，而Apo A1对早期膀胱癌的诊断敏感性和特异性分别为83.8%和94.0%，AUC值为0.978[7]。另一项研究表明，在双向电泳质谱分析(2 dimensional electrophoretic-mass spectrometry，2-DE MS)中，APO A1在膀胱癌患者和正常对照组的尿液中的表达也存在差异，APO A1诊断膀胱癌的敏感性和特异性分别为89.2%和84.6%，而脱落性尿细胞学联合尿液Apo-A1检测可进一步显著提高膀胱癌诊断的敏感性(93.7%)，表明Apo-A1可能是诊断膀胱癌的一个潜在的生物标志物[8]。而转胶蛋白2(Transgelin 2，TAGLN2)是最近在膀胱癌的蛋白质组中发现的一个新的生物标记物，Chen等[9]通过液相色谱串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS)共鉴定了3220个蛋白，选取其中7个差异表达的蛋白进一步验证，结果显示肿瘤细胞中SLC3A2、STMN1和TAGLN2三种蛋白水平较非癌性膀胱上皮细胞显著升高，提示TAGLN2可作为膀胱癌诊断(AUC=0.999)和评估淋巴结转移的有用的肿瘤组织标志物。另外，ELISA结果显示膀胱癌患者尿液中的STMN1和TAGLN2水平也均明显高于对照组，其中膀胱癌尿液TAGLN2值变化最大(是对照组的7.13倍)，AUC为0.700，表明TAGLN2在单个膀胱癌组织和尿液样本中的过度表达最为显著，因此有可能成为膀胱癌非侵入性筛查的潜在生物标志物。

有研究通过二维荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence differential gel electrophoresis，2D-DIGE)和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)鉴定了16种蛋白质，包括膀胱癌患者和正常对照组尿液中的GC-球蛋白。结果显示膀胱癌患者的GC -球蛋白明显高于膀胱良性病变患者和正常对照组。ROC分析表明，以尿液中GC-球蛋白高于161.086 ng/mg为诊断标准，膀胱癌的检测灵敏度为92.31%，特异性为83.02%，表明GC-球蛋白是一种潜在的新型尿液生物标志物，可用于膀胱癌的早期检测和监测[10]。一项大规模、多中心的尿液多肽生物标志物检测膀胱癌的研究，将通过纳入原发性膀胱癌患者(341例)和对照组(110例)以及复发性膀胱癌患者(109例)和相应对照组(316例)，采用毛细管电泳-质谱联用技术(Capillary electrophoresis-mass spectrometry，CE-MS)鉴定尿液多肽生物标志物，并分别建立116个多肽与106个多肽分析模型，其中116个多肽模型检测原发性膀胱癌的敏感性为91%，特异性为68%，AUC为0.87。106个多肽模型检测复发性膀胱癌的敏感性为87%，特异性为51%，AUC为0.75，表明以尿液为基础的尿液多肽检测有望在门诊对膀胱癌患者进行非侵入性检测[11]。Krochmal等[12]研究显示，在单肽水平上整个训练集显示36种多肽是疾病复发的独立诊断标志物，在测试队列中也显示该模型对膀胱癌的复发具有显著的诊断意义，且将尿液多肽整合到诊断模型中可以进行膀胱癌复发的定量风险评估，表明尿液多肽分析在临床治疗中具有重要价值。

在筛选血液标志物的研究中，Lemańska-Perek等[13]则通过膀胱癌患者的血液标本，结合图像凝胶分析和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF)，绘制尿路上皮癌患者血浆蛋白质组图谱，并与正常标本进行比较，通过分析区分出3组与正常样品不同的蛋白质：第一组包括正常血浆中不存在的血浆转铁蛋白、纤维蛋白原γ和补体C3b的修饰形式，第二组包括结合珠蛋白、α-2-巨球蛋白、维生素D结合蛋白和色素上皮衍生因子(大量存在于癌组织中)。第三组由免疫球蛋白M的3种分子形式组成，其在膀胱癌患者血浆样品中显著降低，表明血浆生物标记物与伴随膀胱癌的炎性反应、免疫和凝血过程有关，有望用于临床测试。而在筛选肿瘤标本标志物的研究中，通过LC-MS对膀胱癌标本(117例原发性膀胱癌)进行蛋白质组学分析，其中98例为非肌层浸润性膀胱癌(non muscle invasive bladder cancer，NMIBC)患者、19例为MIBC患者，结果共筛选出三种NMIBC蛋白亚型(NMIBC proteomic subtype，NPS)：NPS1与低分化相关，NPS2与中分化相关，NPS3与高分化相关，且NPS1与MIBC蛋白组关系密切，而NPS3与MIBC蛋白组无关，表明肿瘤组织中的NPS可用于对膀胱癌患者恶性程度的分析[14]。

在膀胱癌鉴别诊断中，反应性尿路上皮异型性的膀胱炎和原位癌(carcinoma in situ，CIS)之间的组织病理学鉴别较困难，有研究基于LC-MS的蛋白质组分析对膀胱炎和浸润性高级别尿路上皮癌标本进行研究，其中AHNAK2可区分膀胱炎和膀胱原位癌，其敏感性为97%，特异性为69%，表明AHNAK2可以区分急慢性膀胱炎的反应性尿路上皮异型性改变和膀胱原位癌[15]。

2 肾癌标志物

肾细胞癌是成人肾脏最常见的肿瘤，约占所有肾脏恶性肿瘤的90%。活检是确诊肾癌的关键，但活检是一种有创性的手术，成功率为70%～80%，且通过肾活检获得的肾组织通常是有限的，在某些情况下，也可能无法确诊。非侵入性尿液生物标志物的鉴定有助于指导治疗决策，减少过度治疗。Di Meo等[16]通过纳入33例肾嗜酸细胞瘤(直径≤4 cm)，30例进展性和26例非进展性Pt1a期肾透明细胞癌(肾脏两级直径≤4.0 cm)，以及26例健康对照，通过LC-MS蛋白质组学方来识别和验证肾细胞癌的早期非侵入性尿液生物标志物，并评估了115例尿液样本。结果显示有6种蛋白在透明细胞中的表达明显高于健康对照组(其中GLRX和CST3蛋白的诊断性能最好)，且与低表达的肾细胞癌患者相比，CST3高表达的患者存活率明显更低。另外，C12ORF49和EHD4蛋白在透明细胞癌中的表达明显高于肾嗜酸细胞瘤，EPS8L2、CHMP2A、PDCD6IP、CNDP2和CEACAM1蛋白在进展期肾透明细胞癌表达又显著高于非进展期，而其中EPS8L2联合CCT6A对于进展期与非进展期肾透明细胞具有较强的鉴别能力(曲线下面积为0.81)，且I-IV期患者EPS8L2和CCT6A mRNA发生改变的患者总生存期明显短于未发生改变的患者，表明尿蛋白的蛋白组学分析有利于早期肾细胞癌进展情况的分析，有利于临床对患者进行更有效的治疗。Stella等[17]则进一步研究了与透明细胞肾癌肿瘤分级相关的蛋白改变，通过MALDI-MSI进行分析，最终确定了波形蛋白和三个组蛋白(H2A、H3和H4)，它们能够区分4个不同级别的透明细胞肾癌。

而通过血清学方法对肾癌的早期无症状诊断和监测治疗效果也至关重要。Kaysheva等[18]通过纳入36例肾癌患者与20例健康志愿者采集血浆进行质谱分析，对肾癌患者和健康志愿者血浆样本的蛋白质成分进行比较分析显示，两组患者大部分蛋白质都位于细胞外，患者血浆中识别出的蛋白质水平要高出20%～50%，但对照样品和肾癌患者血浆样本在蛋白质组成上相似，肾癌患者中70%～80%的鉴定结果与对照组一致，且蛋白质的生物过程高度相似，同时对于免疫状态的蛋白质也没有显著的差异性，因此，血浆检测对于肾癌患者的筛查可能目前仍无法实现。但Chinello等[19]则将尿液与血浆蛋白检测结合用于肾癌的研究，该研究通过纳入血管浸润性肾细胞癌的患者，通过nLC-ESI-MS在尿液和血浆中鉴定出1207和156个蛋白；且分别有574种尿蛋白和58种血浆蛋白与肾癌血管受累相关，但随着血管受累程度的加重，尿中仅有3种蛋白(UROM、Rala、CNDP1)和2种血浆蛋白(APO A1、K2C1)的降低，且26种尿蛋白升高。其中载脂蛋白A-1(APO A1)被证明与肾癌预后相关，即低APOA1血清水平与较差的总体生存率和较短的无病生存期相关。正常尿液与血液中部分蛋白质存在重叠，但当肾静脉受累时，血浆与尿液中蛋白重叠性减低，因此，对于肾癌累计血管的患者，尿液与血浆蛋白的检测具有互补性，可提高检测效能。

在肾癌肿瘤组织的检测中，陈壮飞等[20]采用荧光差异双向凝胶电泳技术筛选癌旁正常肾组织及肾透明细胞癌差异表达蛋白质点，然后通过质谱技术鉴定差异表达蛋白质点。结果显示，经质谱技术共鉴定出26种差异表达蛋白质(15种蛋白质在肾癌组织中下调，11种蛋白质上调)，其中醛糖1-表异构酶、酰基辅酶A脱氢酶、CAPG、微纤丝相关糖蛋白4PRDX4、β-防御素107是首次采用蛋白质组学技术成功筛选的肾癌差异表达蛋白质，并发现了1个预测蛋白(UCRIL)，表明上述差异表达蛋白有望成为肾癌分子生物学标记物。

3 前列腺癌标志物

血清PSA是前列腺癌(prostate cancer，PCa)的特异性标志物，因此有研究通过使用基于MS的蛋白质组学方法分析联合血清PSA检测对PCa进行诊断，其中神经肽Y联合PSA检测PCa的敏感性为81.5%，特异性为82.2%，AUC值为0.88[21]；CD14联合PSA的敏感性为81%-94%，特异性为84%-100%[22]。Ummanni等[23]在PCa患者血清中发现抗过氧化物氧化还蛋白6和膜联蛋白A11的自身抗体也可作为PCa的诊断指标，可用于PCa患者的鉴别，上述两种抗体单独检测的敏感度在70%-80%，而两种抗体联合使用对PCa的诊断敏感度90%、特异度100%。

血清PSA的连续升高是进展性疾病的敏感指标，ADT治疗后7个月的血清PSA下降已被观察到与长期反应有一定程度的关联，但目前还无证据显示PSA治疗前的水平可作为预测标记物。而Kohli等[24]通过反相液相色谱与串联质谱联用的方法，研究了激素敏感型PCa患者的血清蛋白质组，以确定与雄激素剥夺治疗疗效相关的候选生物标志物，结果显示17-β-雌二醇、活化B细胞复合体的核因子κ轻链增强子和P38丝裂原活化蛋白激酶可能是雄激素剥夺治疗反应的潜在预测标记物。

在PCa中，Gleason分级常用于评估PCa患者的预后，但该方法常需要活检，有研究探讨与Gleason评分相关的新型蛋白质组生物标记物用于PCa侵袭性的预测。其中Al-Ruwaili等[25]使用表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)分别对低Gleason评分和高Gleason评分PCa患者的血清蛋白进行分析，结果显示共鉴定18个差异表达蛋白可用于鉴别侵袭性与惰性PCa，且敏感性与特异性分别为70%、62.5%。Fujita等[26]则通过检测尿液蛋白发现尿液中的脂肪酸结合蛋白5在PCa组高于阴性组，且与Gleason评分显著相关，且ROC曲线显示脂肪酸结合蛋白5预测Gleason评分>6的PCa的AUC值为0.757，显著高于血清PSA预测的AUC值(0.593)，因此尿脂肪酸结合蛋白5可作为高Gleason评分PCa的潜在生物标志物。Kwon等[27]通过串联质谱定量蛋白质组学方法对胰蛋白酶多肽进行分析，以鉴定突变多肽作为晚期PCa的新生物标志物，结果显示INTS7水平的升高和SH3BGRL水平的降低也与PCa的侵袭性有关，而在PCa细胞系中鉴定出70个突变肽，其中7种突变肽在肿瘤组织中的表达发生了变化，而CAPN2 D22E是PCa组织中表达上调最显著的突变肽，表明PCa组织中存在的突变肽也可作为晚期PCa的标志物[28]。

PCa常需要与良性前列腺增生进行鉴别，而Totten等[29]通过定量蛋白组质谱方法和多联凝集素亲和色谱研究了血清蛋白及其糖型，结果显示，与良性前列腺增生对比，PCa样本中CFP、C8A、CD5L、C7、BST1显著增加，且C4BPB 和AZGP1糖基类型也存在变异，可用于PCa的鉴别诊断。

研究显示，肿瘤的基因拷贝数、DNA甲基化和mRNA表达水平的差异并不能可靠地预测蛋白质组的变化，因此在蛋白质水平上没有功能效应，表明蛋白质组对于肿瘤生长及进展的分子机制研究具有重要意义[30]。而上述早期研究结果也表明，基于质谱的蛋白质组学技术有望成为临床泌尿生殖系统肿瘤检测、早期诊断或鉴别诊断、预后分析、疗效评估等的筛查或检测工具。

随着基于MS的蛋白质组学不断改进，将会有更多的生物标志物候选在血液或尿液样本中被检测，用于非侵入性的临床应用。尽管使用蛋白质组学技术发现了许多新的候选蛋白质生物标记物，但不同生物标记物联合检测肿瘤比单一标记物更具挑战性，因为单一标记物的检测通常有明确的临界浓度值，且该领域目前仍处于生物标志物发现阶段，可获得的相关研究仍然有限，未来需要更多的研究以评估新型生物标记物的有效性和经济性等方面。