RP-HPLC定量分析茶叶中几种主要儿茶素类有效成分*

刘少静，谭 雄，王晓茹，张德柱，秦 蓓,

（1.西安医学院 药学院，陕西 西安710021；2.成都医学院 药学院，四川 成都610500；3.陕西盘龙药业集团股份有限公司，陕西 西安710025；4.陕西功能食品工程中心有限公司，陕西 西安710065）

茶叶是传统的药食同源天然保健饮品，茶多酚是茶叶中酚类化合物及其衍生物总称，包括儿茶素类、黄烷醇类、花青素类、黄酮类和酚酸类等[1,2]。茶多酚具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌消炎、降血糖、降血脂、预防肝脏及冠状动脉粥样硬化等广泛药理作用。被广泛应用于食品、功能性饮料、保健品及化妆品中[3,4]。儿茶素类化合物是茶多酚类物质的主要药理活性成分，含量占比可达60%～80%。文献调研表明，儿茶素可抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡；具有预防心脑血管疾病及保肝护肝、抗菌、抗病毒等药理作用[5,6]。

其中，没食子儿茶素（GC）、表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）5种化合物是茶叶质量控制的关键成分[7,8]，目前，较多文献报道了紫外分光光度法及高效液相色谱法测定茶叶中茶多酚的含量[3,9]，但较少对茶多酚中各单体有效成分进行分析比较，因此，本研究建立了RP-HPLC定量分析5个品种茶叶中5种儿茶素类成分，为茶叶的质量控制提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

Agilent1260高效液相色谱仪（美国Agilent科技有限公司）；FA1004B型电子天平（0.1mg，上海越平科技仪器有限公司）；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

对照品GC、EGC、EGCG、EC、ECG（中国药品生物制品检定所提供，纯度≥98%）；5种茶叶均购自西安轻工茶叶批发市场，由西安医学院药学院秦蓓教授鉴定；甲醇（色谱纯 美国fisher公司）；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色 谱 柱：Agilent ZORBAX ODS C18（5μm×4.6mm×250mm）；检测波长：280nm；柱温：30℃；流速：0.8mL·min-1；进样量：5μL；流动相（甲醇∶2‰磷酸水溶液）：0～7min：28∶72，7～15min：20∶80，15～35min：28∶72。

1.2.2 溶液制备

（1）对照品溶液的制备 分别精密称取GC（5mg）、EGC（5mg）、EGCG（2.6mg）、EC（2.9mg）、ECG（3.1mg）对照品适量，加流动相溶解并定容至容量瓶中，制得对照品母液。精密吸取一定量母液，采用流动相逐级稀释配制成系列混合对照品溶液，其中GC、EGC浓度依次为：100、200、250、300、350、400μg·mL-1；EGCG浓度依次为：104、138.67、173.33、260、390、520μg·mL-1；EC浓度依次为：116、154.67、193.33、290、435、580μg·mL-1；ECG浓度依次为：124、165.33、206.67、310、465、620μg·mL-1。4℃冷藏备用。

（2）样品溶液的制备 茶叶揉碎，称取5个品种茶叶各约5.0g，置于锥形瓶中，分别按照1∶30的料液比加入60%乙醇水溶液，于80℃下超声提取50min，抽滤，滤液定容至250mL容量瓶中，过0.22μm有机微孔滤膜后进行HPLC分析。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

由于儿茶素类化合物中酚羟基的存在，其具有一定酸性，为保证良好的色谱峰型及分离度，向流动相体系（甲醇-水）中加入H3PO4并进行梯度洗脱，在该色谱条件下，5个主成分色谱峰均获得良好分离度。图1为色谱图。

图1 色谱图Fig.1 HPLC chromatogram

2.2 线性关系

按照拟定色谱条件对系列混合对照品溶液进行HPLC检测，以样品浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标进行线性回归。5种儿茶素类化合物的保留时间、回归方程、相关系数和线性范围见表1。

表1 5种成分的回归方程、相关系数与线性范围Tab.1 Regression equation,correlation coefficient and linear range of five components

由表1可见，5种化合物在一定浓度范围内线性关系良好。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 将混合对照品溶液在拟定色谱条件下连续进样5次（进样量：5μL），记录色谱峰面积，计算GC、EGC、EGCG、EC、ECG峰面积的RSD，分别为0.26%、0.21%、0.36%、0.22%和0.37%，表明精密度良好。

2.3.2 重复性试验 称取同一供试样品（安吉白茶）5份，各约5.0g，按照“1.2.2”项下方法平行制备5份样品溶液，于拟定色谱条件下进样（进样量：5μL），考察5个化合物峰面积变化，计算GC、EGC、EGCG、EC、ECG峰面积RSD分别为2.43%、1.87%、3.78%、1.64%和3.47%，表明方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取供试品（安吉白茶）溶液，在拟定色谱条件下，分别于0、4、8、12、18、24h进样检测，记录色谱峰面积。结果GC、EGC、EGCG、EC、ECG峰面积的RSD分别为1.26%、2.03%、3.58%、1.73%和3.63%。表明供试品溶液在24h内稳定。

2.3.4 加样回收率试验 精密称取含量已知的同一批供试品（安吉白茶）粗粉5份，各约2.5g，置于锥形瓶中，分别加入5种儿茶素对照品适量，制备供试品溶液并进样分析。计算GC、EGC、EGCG、EC、ECG的平均回收率（n=5）分别为：98.83%（RSD=2.81%）、98.80%（RSD=2.46%）、97.83%（RSD=2.91%）、100.41%（RSD=1.64%）、99.38%（RSD=2.54%）。

2.4 样品测定

在拟定色谱条件下，对5个供试品溶液进行HPLC分析检测，记录5个儿茶素类化合物的峰面积，带入标准曲线方程，计算含量。结果见表2。

表2 5种绿茶中儿茶素类化合物含量测定结果（%，n=3）Tab.2 Result of content determination of 5 samples（%,n=3）

将各个样品的HPLC谱图与5种对照品谱图进行对比分析，发现5个不同品种茶叶中均含有GC、EGC、EGCG、EC、ECG 5种化合物，由表2可见，不同品种茶叶中含量最高的均为EGCG、其次为EC、含量最低的为ECG。不同品种茶叶之间儿茶素类含量存在一定差异。

3 结论

儿茶素类化合物是茶叶中主要药理活性成分，不同品种茶叶中儿茶素类成分含量存在差异。本文建立了高效液相色谱法测定5种茶叶样品中5个儿茶素类化合物含量，该方法快速、准确、分离度高。这种质控标准的建立为茶叶品质的保证及茶多酚类产品的质量控制提供了依据。