新型冠状病毒SARS-CoV-2简介及黑腹果蝇在该病毒研究中的潜在应用

陈 笛 蓝 晓 蔡 华

果蝇是已经被使用了一百多年的模式生物，在生物学和医学发挥着重要的作用，主要有以下几点优势[1]：①果蝇个体小，发育快，养殖成本小，无伦理问题，可进行大规模操作；②具有非常成熟完善的遗传学背景，基因组全测序并注解，具有完善的基因敲除等遗传学操作工具；③对发育，代谢，免疫等相关功能以及分子通路可实现全基因组无偏见的体内筛选，也可为新的调控机制和生物反应过程提供新的发现；④在生物医学领域里值得引起关注的是，75%已知的与人类健康/疾病相关的基因在果蝇中有同源基因。的确，果蝇在天然免疫识别病原体领域做出巨大贡献。果蝇不具有适应性免疫，只具有天然免疫，然而果蝇却可以抵抗大多数病毒、细菌和真菌的感染，提示天然免疫在抵抗病原体感染中的重要作用。法国国家科研中心朱尔斯霍夫曼教授利用果蝇为模型，发现Toll受体在识别真菌和细菌感染中的作用，革命性的改变了对天然免疫的理解，而获得2011年诺贝尔生理与医学奖。截止目前，已经有六个诺奖授予果蝇相关的研究。

新型冠状病毒可感染人、猪、牛、猫、犬、貂、骆驼、蝙蝠、老鼠和刺猬等，严重威胁人类健康(1)。2019年底爆发的SARS-CoV-2疫情，截止目前已导致超过380万人感染，目前没有有效的可供临床使用的疫苗和特效药，对SARS-CoV-2的了解也非常有限。本文将首先简要介绍SARS-CoV-2以及生命周期，然后思考黑腹果蝇模型在SARS-CoV-2研究中的潜在应用。

1 新型冠状病毒SARS-CoV-2

冠状病毒SARS-CoV-2是一种直径为120nm球形带有囊膜的病毒，基因组为正链单股RNA，基因组大小为～ 29.87 -29,891bp[2-3]。病毒RNA 5’端具有Cap结构，3’端多聚腺苷化，具有多个开放读码框。基因的表达顺序是5’-replicase-S-E-M-N-3’。起始的大约2/3基因组表达多聚蛋白pp1ab，后者可被剪切为16个非结构蛋白。靠近3’端基因组表达结构蛋白，包括S蛋白、囊膜蛋白E、膜蛋白M和核衣壳蛋白N。

2 SARS-CoV-2的生命周期

SARS-CoV-2生命周期与大多数病毒一样，包括三个阶段入侵、复制和包装释放阶段。病毒囊膜上S蛋白可在宿主组织蛋白酶L(cathepsin L)切割为S1和S2两个亚基，其中S1亚基与受体结合，并诱发S2亚基发生构象改变，后者使得病毒囊膜与细胞膜融合，然后释放出SARS-CoV-2病毒核衣壳。SARS-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白的氨基酸序列一致性为76.47%[4]，二者都利用血管紧张素转换酶2(ACE2)为入侵受体[4-6]。SARS-CoV-2主要感染表达于富含有ACE2的支气管上皮细胞和人肺II 型上皮细胞。病毒壳子进入细胞后，释放到细胞内的SARS-CoV-2基因组开始以Cap依赖的方式翻译病毒蛋白，包括多聚蛋白pp1a和pp1ab。二者可被蛋白酶剪切为15-16个非结构蛋白。其中nsp3编码木瓜样蛋白酶(PLPro)。nsp5编码主要蛋白酶(Mpro)。这两种酶可作为药物研发的重要靶点。nsp3、nsp4和nsp6诱导细胞内膜结构形成双层膜结构，这是复制转录复合物组装(RTC)的地方。nsp12编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)。

病毒RNA复制时，利用病毒基因组正链RNA为模板合成负链的RNA，后者可作为模板进一步合成新的基因组正链RNA。病毒基因组的复制和转录主要都在RTC中进行，由病毒复制酶介导的。病毒颗粒的包装发生在内质网和高尔基体的中间结构上。在病毒颗粒组装时，病毒的M蛋白作为支架，利用结构蛋白间的相互作用招募结构蛋白到包装复合物上。E蛋白与M蛋白相互作用促进病毒颗粒包装并且会诱导膜结构形成。最终，形成的病毒颗粒通过实壁囊泡分泌到细胞外。

3 SARS-CoV-2的致病性

关于SARS-CoV-2的致病蛋白，目前认识还比较有限。结合SARS-CoV的研究结果，我们可以推断SARS-CoV-2的几种致病或者潜在致病蛋白，包括S蛋白以及一些非结构蛋白。SARS的S蛋白注射小鼠可以起急性的肺损伤，并且阻断肾素-血管紧张素通路可以减轻肺损伤[7]。SARS-CoV-2感染可以诱发肝脏损伤，胃肠异常。最近的一些研究表明SARS-CoV-2可感染肠道细胞[8]。此外，一些研究表明，SARS-CoV-2的其他结构蛋白也具有致病功能。

4 黑腹果蝇在SARS-CoV-2致病性研究中的潜在应用

果蝇的脂肪体类似于人类的肝脏，具有气道和肠道。构建S蛋白的转基因果蝇，然后评价果蝇S蛋白对气道，脂肪体和肠道的影响，将可能揭示S蛋白致病的机制。此外，构建其他潜在的致病蛋白，并观察果蝇生存率，运动，消化等指标，有助于揭示新的致病机制。利用果蝇的组织特异性的Gal4和果蝇的UAS驱动的过表达系统，将实现果蝇组织特异性的表达不同的SARS-CoV-2蛋白，从而更好的研究SARS-CoV-2蛋白在不同组织器官中的致病性。

5 黑腹果蝇在SARS-CoV-2诱导的天然免疫研究中的潜在应用

黑腹果蝇是天然免疫研究的模式生物。截止目前，在抗病毒研究方面，果蝇感染模型可以为人类的抗病毒天然免疫提供重要的研究模型，发现了一系列保守的抗病毒机制[9]，比如Jak-Stat通路[10]、STING-IKKβ[11]抗等。近几年发现哺乳动物中也存在抗病毒RNAi通路，从而表明果蝇的RNAi[12, 13]抗病毒通路在进化上也被保留下来。此外一些研究表明果蝇抵抗细菌和真菌的Toll和IMD信号通路也参与病毒感染[14-15]。Toll于IMD类似哺乳动物细胞中的Toll和TNF-α通路。在抗病毒天然免疫方面果蝇相对于哺乳动物中的保守性，为研究SARS-CoV-2诱导的抗病毒通路提供重要的备选。尽管目前没有证据表明，SARS-CoV-2能够感染黑腹果蝇，但是可以通过以下办法利用果蝇研究SARS-CoV-2对天然免疫的调控作用：构建SARS-CoV-2蛋白的转基因果蝇，然后观察不同天然免疫信号通路下游基因的变化，从而发现潜在SARS-CoV-2的天然免疫通路抑制蛋白。

6 果蝇SARS-CoV-2替代研究模型的可行性

水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)是人畜共患病毒，可以在果蝇中感染复制并建立有效的感染[13-14, 16]。SARS-CoV-2病毒的S蛋白替VSV的G蛋白，从而构建成功可以表达S蛋白，包裹着VSV基因组的SARS-CoV-2的假病毒。另外，通过构建人源ACE2的转基因果蝇，从而可能实现SARS-CoV-2的VSV假病毒，感染表达ACE2的转基因果蝇，从而实现果蝇的SARS-CoV-2的替代研究系统。该系统可以在普通的生物安全二级实验室进行，解决SARS-CoV-2只能在生物安全三级实验室进行的限制。该模型可以用于中和抗体评价或者针对S蛋白与ACE2结合抑制剂[17]的评价。

7 黑腹果蝇在抗SARS-CoV-2药物筛选研究中的潜在应用

黑腹果蝇是药物筛选的重要模型，其优势在于可进行大规模的活体筛选。当下对SARS-CoV-2的抗病毒药物筛选是在细胞水平进行验证，需要活体抗病毒数据的支持。以下系统可能作为潜在的SARS-CoV-2药物筛选研究系统。①SARS-CoV-2蛋白的转基因果蝇，如果果蝇表现出一些病变的表型，该表型可以作为药物筛选模型；②SARS-CoV-2的VSV假病毒模型结合人源化ACE2转基因果蝇，可为SARS-CoV-2研究提供果蝇替代模型，可作为抗病毒药物筛选系统。

8 讨论

本文综述了SARS-CoV-2的分子病毒学和生命周期。思考并总结了黑腹果蝇在SARS-CoV-2研究中的潜在应用，包括在SARS-CoV-2致病性，天然免疫调控，感染系统建立以及抗病毒药物筛选中的潜在应用。利用果蝇模型研究SARS-CoV-2主要有以下几方面的优势：①黑腹果蝇作为经典的遗传学研究模型，可进行全基因组水平的基因筛选；②SARS-CoV-2的VSV假病毒模型，结合人源ACE2转基因果蝇，将可能解决只能在生物安全三级实验室操作SARS-CoV-2活病毒的限制；③果蝇具有诸多保守的抗病毒天然免疫通路，可以实现快速筛选SARS-CoV的天然免疫抑制蛋白。④果蝇具有与人类一定程度相似的肝脏，气道和肠道，为研究SARS-CoV-2蛋白的组织致病性提供重要的替代研究模型。