circRNA在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展

田立群，黄琴，夏中元

(武汉大学人民医院麻醉科，武汉 430060)

环状RNA(circular RNA，circRNA)于20世纪70年代初首次被发现[1]，但迄今为止关于circRNA的报道并不多见。近年来，高通量转录组测序技术和计算算法的发展使circRNA在动物体内的普遍性得到证实[2-3]。与其他种类RNA不同，circRNA由反向剪接产生，是一种缺乏游离3′端和5′端共价闭合的环状分子，可分为外显子circRNA、外显子-内含子circRNA和内含子circRNA三类[3-5]。circRNA一直被认为是异常剪接的副产物，但目前越来越多的研究发现circRNA具有复杂的生物学功能，如“海绵”微RNA(micorRNA，miRNA)、与蛋白质相互作用、调节亲本基因的表达、翻译等[4,6-10]。circRNA与神经系统疾病、退行性疾病、肿瘤和心血管系统疾病等密切相关[11]。临床上常通过血运重建治疗缺血性心脏病，而恢复血运的心肌仍可能遭受心肌细胞坏死、组织结构紊乱等进一步损害，即心肌缺血再灌注损伤[12-13]。心肌缺血再灌注损伤造成的损伤面积可达全部心肌梗死面积的50%[14]。因此，解决这一难题在临床上具有十分重要的意义。多项研究在心肌缺血再灌注损伤过程中检测到circRNA差异表达，表明circRNA可能参与心肌缺血再灌注损伤的过程[15-17]。现就circRNA在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展予以综述。

1 circRNA概述

1.1circRNA的生物发生和分类 前体信使RNA通过规范剪接去除内含子生成可作为翻译模板的成熟信使RNA，这种剪接模式主要通过识别内含子3′端一个特征性AG位点和内含子5′端一个GU位点来实现[18]。circRNA是一种共价闭合的环状分子，没有3′端“多聚腺苷尾”和5′端“帽子结构”，主要通过反向剪接产生，与规范剪接不同，反向剪接通常不需要特定的顺序，但需要侧翼内含子元件之间的碱基配对[19]。Jeck等[20]通过生物信息学分析发现，外显子环化需要含有互补ALU重复序列的长边界内含子；此外，规范剪接得到的信使RNA中外显子的相对顺序与基因组中外显子的顺序相匹配，但反向剪接涉及测序读数中外显子顺序的破坏。

根据来源不同circRNA可分为3类，其中外显子circRNA源于外显子序列，主要存在于细胞质，占circRNA的大多数[3]；外显子-内含子circRNA兼具外显子和内含子序列，被认为是生成外显子circRNA的中间产物，位于细胞核内[5]；内含子circRNA仅由内含子组成，大多存在于细胞核内[4]。外显子circRNA具有多种功能，其中研究最多的是miRNA的“分子海绵”作用，而内含子circRNA几乎不具备此功能[4]。外显子-内含子circRNA和内含子circRNA主要存在于细胞核内，可以影响基因的转录过程[4,5]。

1.2circRNA的生物学功能

1.2.1充当miRNA“海绵” circRNA的生物学功能中研究最多的是circRNA对miRNA的“海绵”作用，即circRNA与miRNA碱基互补配对，干扰miRNA使其无法与相应靶标结合，影响其对下游靶基因的调控。例如，心脏相关circRNA可通过靶向结合miR-223促进胱天蛋白酶(caspase)募集结构域的表达，抑制心脏肥大和心力衰竭[21]。circRNA可以包含单个miRNA的多个结合位点，如小脑变性相关蛋白1反义转录物(cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，Cdr1as)转录生成的circRNA Cdr1as分子在哺乳动物大脑中高表达，含有约70个miR-7结合位点，可以吸附miR-7并降低其活性，导致相应靶标水平升高[2]。此外，circRNA也可对多种不同的miRNA起“海绵”作用，如circ-HIPK3(homeodomain-interacting protein kinase 3)可以结合多种miRNA(miR-124、miR-152、miR-193a、miR-29a、miR-29b、miR-338、miR-379、miR-584和miR-654)，从而调控多个靶基因的表达[22]。

1.2.2与蛋白质相互作用 盲肌样蛋白(muscle blind，MBL)基因的第2个外显子在果蝇和人类中被环化成circRNA，即circMBL[8]。Ashwal-Fluss等[8]发现，circMBL含有保守且特异的MBL结合位点，当MBL含量丰富时，circMBL通过与MBL结合减弱其生物利用度。circRNA不仅能直接影响蛋白质含量，还可影响蛋白质的亚细胞定位。例如，由叉头框转录因子O3(forkhead transcription factor O3，FoxO3)基因环化产生的circ-FoxO3主要分布在细胞质中，可与细胞分化抑制因子-1、E2F转录因子1以及黏着斑激酶和缺氧诱导因子-1α相互作用，使细胞分化抑制因子-1、E2F转录因子1、缺氧诱导因子-1α不能进入细胞核，因此黏着斑激酶不能进入线粒体发挥作用，最终导致细胞衰老加重[9]。另外，circRNA还可充当蛋白质支架，促进蛋白质之间的相互作用。Du等[23]发现，circ-FoxO3可以与细胞周期蛋白依赖性激酶2和p21相互作用形成三元复合物，使细胞质中p21和细胞周期蛋白依赖性激酶2间的相互作用增强，从而阻止细胞周期蛋白依赖性激酶2与细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E的相互作用以及随后的细胞周期进程。

1.2.3调节亲本基因的表达 多种位于细胞核的circRNA可通过调节RNA聚合酶Ⅱ影响亲本基因的转录。RNA和蛋白质的共鉴定结果表明，源自锚蛋白重复结构域52(ankyrin repeat domain 52,ANKRD52)基因的ci-ANKRD52可与RNA聚合酶Ⅱ复合体结合，而敲低ci-ANKRD52的表达，ANKRD52基因转录水平则下调；另一个由沉默信息调节因子7(silent information regulator 7，SIRT7)基因环化产生的内含子circRNA-ci-SIRT7也以相同机制调节组蛋白去乙酰化酶7基因的表达[4]。这项研究表明，某些circRNA可充当RNA聚合酶Ⅱ转录的正向调节剂，在其亲本基因的有效转录中发挥作用。

综上，某些位于细胞核内的circRNA可以在转录水平影响亲本基因的表达。而外显子circRNA通过合成时的反向剪接与前体信使RNA的规范剪接形成竞争，在剪接水平影响基因表达[24]。例如，circMBL的反向剪接与MBL前体信使RNA的规范剪接相互影响，当MBL表达过量时，circMBL的反向剪接增强，circMBL产生增加，而MBL前体信使RNA的规范剪接减弱时，则自身信使RNA的产生减少[8]。

1.2.4翻译多肽或蛋白质 circRNA缺乏帽依赖性翻译的必需元件，如3′端“多聚腺苷尾”和5′端的“帽子结构”，通常被认为不具备翻译功能[25]。事实上，早在1995年Chen等[26]就发现circRNA具有内部核糖体插入位点，并对circRNA的编码功能进行了初步描述。部分circRNA可以翻译功能性蛋白质或多肽。例如，circZNF609是源于锌指蛋白609(zinc finger protein 609，ZNF609)基因第2外显子的单外显子circRNA，包含一个开放阅读框，该框的长度与线性转录本相同，自起始密码子始，终止于在环化过程中创建的框内STOP密码子，通过多核糖体分析发现，circZNF609与重链多核糖体组分结合，并以剪接依赖性的方式翻译蛋白质[10]。由SHPRH(SNF2 histone linker PHD RING helicase)基因环化产生的circ-SHPRH使用重叠的遗传密码生成“UGA”终止密码子，实现SHPRH-146aa的翻译，SHPRH-146aa保护全长SHPRH免受泛素蛋白酶体的降解，具有肿瘤抑制剂的功能[27]。circ-F框/WD-40域蛋白7(F-box and WD-40 domain protein 7,FBXW7)可由内部核糖体插入位点驱动开放阅读框编码一种新的蛋白质——FBXW7-185aa，FBXW7-185aa可以协同亲本基因FBXW7，降低c-Myc蛋白的表达，促进c-Myc的泛素化降解，从而抑制胶质瘤的发生[28]。预计有多个circRNA序列包含一个由内部核糖体插入位点驱动的开放阅读框[29]，但目前只有少部分的circRNA被证实可做翻译模板，未来还需更多的研究探索circRNA的这一生物学功能。

2 circRNA与心肌缺血再灌注损伤

2.1circRNA与心肌缺血再灌注过程中的心肌细胞损伤

2.1.1circRNA与心肌缺血再灌注过程中的心肌细胞自噬 自噬是通过溶酶体降解清除受损细胞器的过程，对细胞稳态起重要作用，但过度的自噬激活会损坏大量细胞器，导致细胞坏死。在心肌缺血再灌注损伤的不同时期，自噬具有不同的作用，在缺血期适度的自噬可起到自我保护作用，而在再灌注期自噬过度激活则可导致进一步的细胞损伤，甚至导致细胞坏死[30]。因此，探讨心肌细胞自噬的机制可能为心肌缺血再灌注损伤的治疗提供新思路。Gan等[17]通过在体外对心肌细胞进行缺氧/复氧处理模拟心肌缺血再灌注过程，结果发现，circRNA_101237水平在心肌细胞中显著升高，circRNA_101237小干扰RNA转染可减弱缺氧/复氧介导的自噬激活。circRNA_101237还可通过充当let-7a-5p的“海绵”调节胰岛素样生长因子2信使RNA结合蛋白3的表达，而胰岛素样生长因子2信使RNA结合蛋白3进一步通过调节胰岛素样生长因子2激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路，参与自噬和凋亡[31]。自噬相关circRNA在缺氧/复氧或缺血再灌注的心肌细胞中显著下调，机制研究发现，自噬相关circRNA与DNA甲基转移酶3B直接结合激活了人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因诱导激酶1的表达，而人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因诱导激酶1可使下游FAM65B(the family with sequence similarity 65，member B)的46位丝氨酸磷酸化，抑制心肌细胞的自噬和细胞凋亡[32]。Jin等[33]发现，与心肌缺血再灌注组相比，在心肌缺血再灌注前使用毛柳苷预处理可使circ-0000064表达显著升高，在心肌缺血再灌注前circ-0000064过表达则可通过抑制自噬来保护心肌细胞，减轻心肌缺血再灌注损伤。以上研究表明，心肌缺血再灌注可以诱导心肌细胞circRNA表达模式的变化，部分circRNA通过“海绵”miRNA调控靶蛋白或直接作用于靶蛋白调控自噬通路，最终在心肌缺血再灌注损伤中起作用。通过靶向circRNA药物干预心肌细胞的自噬通路，可为减轻心肌缺血再灌注损伤提供新的干预措施和治疗手段。

2.1.2circRNA与心肌缺血再灌注过程中的心肌细胞凋亡 心肌缺血再灌注过程中心肌细胞的过度凋亡是导致心肌再次损伤的重要原因，但具体机制目前尚不明确。circ膜联蛋白A2和circHIPK3在模拟心肌缺血再灌注过程的心肌细胞中高表达，分别通过“海绵”miR-133和miR-1243p来抑制miR-133和miR-1243p的活性，促进心肌细胞凋亡[16,34]。另有研究发现，心肌缺血再灌注后，circ-0068566在心肌细胞中的表达显著下调，circ-0068566可靶向hsa-miR-6322/聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-2通路发挥作用，上调circ-0068566可减轻缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡[35]。上述研究结果表明，心肌缺血再灌注可引起心肌细胞circRNA表达谱的改变，而circRNA的上调或下调可通过靶向调控miRNA促进或抑制心肌缺血再灌注过程中的心肌细胞凋亡。

2.1.2.1circRNA与凋亡的线粒体通路 线粒体是细胞凋亡的调控中心，而凋亡的线粒体通路是指各种刺激引起线粒体外膜通透性增加，细胞色素C释放进入胞质，与细胞凋亡蛋白酶活化因子-1结合，激活caspase，引起级联反应，导致细胞凋亡[36]。研究表明，circRNA/miRNA/靶基因轴可能通过凋亡的线粒体通路参与心肌缺血再灌注损伤[15,37]。线粒体分裂与凋亡相关的circRNA在缺氧/复氧或缺血再灌注的心肌细胞中显著升高，通过直接靶向下调miR-652-3p，降低miR-652-3p对MTP18(mitochondrial protein 18 kDa)翻译的抑制作用[15]。MTP18是一种核编码的线粒体膜蛋白，有助于哺乳动物细胞中的线粒体裂变，线粒体过度分裂可导致线粒体外膜通透性增加以及细胞色素C等凋亡触发因子释放，激活caspase，诱导细胞凋亡[38]。研究发现，circRNA-4087在心肌缺血再灌注过程中显著上调，circRNA-4087可与miR-16结合调控细胞凋亡，circRNA-4087过表达可导致线粒体功能障碍以及caspase-3、Bcl-2相关X蛋白等促凋亡蛋白表达显著上调，而下调的circRNA-4087可增加心肌细胞内腺苷三磷酸的含量，降低线粒体活性氧类的生成，抑制心肌细胞凋亡[37]。

2.1.2.2circRNA与凋亡的内质网通路 内质网是蛋白质合成、折叠修饰、脂质代谢以及维持细胞内钙离子稳态的重要场所。缺血、缺氧、氧化应激、高糖、高脂等均可导致内质网功能异常，引起未折叠蛋白聚集，导致未折叠蛋白反应，引发内质网应激以恢复内质网稳态，应激因素过强或持续存在，会导致内质网稳态失衡，当细胞本身不能应对这些异常时会过度活化内质网应激，导致细胞凋亡[39]。Geng等[40]发现，Cdr1as/miR-7a轴在心肌梗死小鼠模型中被激活，并促进心肌细胞凋亡。miR-7a/b在大鼠心肌缺血再灌注损伤中的表达上调，在miR-7a模拟物转染的心肌缺血再灌注损伤模型中，大鼠心肌细胞凋亡水平和心肌梗死面积均显著降低[41]。在培养的新生大鼠原代心肌细胞中，模拟缺血或缺血再灌注可以激活未折叠蛋白反应[42]。miR-7a过表达可以激活未折叠蛋白反应期间转录激活因子4/CCAAT增强子结合蛋白环腺苷酸反应元件结合转录因子同源蛋白信号通路，且可显著降低心肌细胞中内质网应激诱导的细胞凋亡[43]。上述研究表明，Cdr1as/miR-7a轴可能通过内质网应激通路促进缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡，但具体作用机制尚待实验验证。

2.1.2.3circRNA与凋亡的死亡受体通路 死亡受体是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)受体超家族的一部分，死亡受体通过与相应配体的结合，调节细胞凋亡的信号转导。凋亡相关因子受体/凋亡相关因子配体和TNF受体/TNF-α是目前研究最多的死亡受体通路。Li等[44]研究发现，circ-钠钙交换体亚型1(sodium/calcium exchanger 1，NCX1)可与miR-133a-3p结合，降低miR-133a-3p对细胞死亡诱导蛋白1(cell death-inducing protein 1，CDIP1)基因的抑制活性，增加细胞对活性氧类的反应，促进心肌细胞凋亡；在小鼠心肌细胞和心脏组织中敲除circNCX1可以降低CDIP1水平，并减轻细胞凋亡和心肌缺血再灌注损伤。CDIP1是促凋亡信号转导子，当细胞受到应激时，CDIP1可上调TNF-α，将死亡受体介导的外在凋亡信号传递到细胞内，促进细胞凋亡[45]，表明circNCX1/miR-133a-3p/CDIP1轴可能通过死亡受体通路促进心肌缺血再灌注损伤。另有研究发现，circ-扰动样激酶1(tousled-like kinase 1，TLK1)在心肌缺血再灌注小鼠模型中过表达，下调circ-TLK1可导致miR-214在心肌缺血再灌注小鼠体内过表达，进而抑制受体相互作用蛋白激酶1和TNF信号通路，显著降低心肌细胞凋亡和心肌组织损伤[46]。

综上所述，circRNA可能通过调节心肌细胞自噬或凋亡参与心肌缺血再灌注损伤。自噬可以通过降解异常蛋白质、受损的内质网和线粒体来维持细胞稳态，但自噬的过度激活则可导致各种细胞凋亡通路被激活[47]。细胞凋亡的通路也并非完全独立，凋亡的线粒体通路、内质网应激通路和死亡受体通路最终都是通过激活下游的caspase家族蛋白酶发挥作用，同时这3条通路还可通过多个反馈回路相互调节[48]。因此，探索circRNA在心肌细胞自噬和凋亡中的具体机制，有助于为靶向circRNA治疗心肌缺血再灌注损伤提供理论依据。

2.2circRNA与心肌缺血再灌注过程中的血管内皮细胞功能障碍 冠状动脉微循环负责为组织提供氧气和营养、去除代谢废物、控制炎症和损伤修复以及进行与组织间的液体交换。血管内皮细胞功能障碍以细胞因子、趋化因子等炎症因子的过度产生和细胞迁移、凋亡的改变为特征，是冠状动脉微循环障碍的重要因素。急性心肌缺血再灌注可诱导内皮细胞功能障碍，造成冠状动脉微循环损害，加重心肌损伤[49]。然而，目前关于心肌缺血再灌注诱导的内皮细胞功能障碍方面的研究较少，因此，探讨心肌缺血再灌注过程中血管内皮功能障碍的相关机制，可以为减轻心肌缺血再灌注损伤提供新的治疗策略。

circRNA可能与心肌缺血再灌注诱导的血管内皮功能障碍的发生相关。Chen等[50]发现，再灌注可致血管内皮细胞中含E6-AP C端(HECT)结构域的E3泛素连接酶1[E6-AP C-terminal(HECT)domain-containing E3 Ub ligase 1，HECTD1]的表达显著降低，同时血管内皮细胞迁移和凋亡增加，上调HECTD1在内皮细胞中的表达可显著减轻心肌缺血再灌注诱导的内皮细胞迁移和凋亡；生物信息学分析结果显示，HECTD1基因的3′非编码区与miR-143有结合位点，而miR-143和circ DLGAP4(discs large associated protein 4，DLGAP4)也有结合位点；再灌注1 h后，内皮细胞的circDLGAP4表达显著降低，而miR-143表达增加2.5倍，内皮细胞过表达circDLGAP4可减轻再灌注12 h引起的HECTD1蛋白表达的下调，表明circDLGAP4通过海绵miR-143调节HECTD1的表达，在血管内皮细胞的迁移和凋亡中起重要作用，参与心肌缺血再灌注损伤的调节。另有研究发现，在心肌缺血再灌注模型中，circRNA-100338在冠状动脉内皮细胞中的表达显著下调；进一步用人脐静脉内皮细胞构建体外缺氧/复氧模型进行机制研究发现，circRNA-100338可能通过与miR-200a-3p结合抑制miR-200a-3p的功能来调控肉瘤融合蛋白，进而调节血管内皮细胞迁移和管状形成[51]。上述研究为心肌缺血再灌注损伤机制的研究提供了新的方向和思路，circRNA在心肌缺血再灌注损伤中的作用不仅局限于心肌细胞，也存在于血管内皮细胞，对相关机制的深入研究还可为临床治疗提供新的靶点，为理想治疗药物的开发提供支持。

3 小 结

circRNA具有组织特异性、种类繁多、性状稳定、功能复杂等特点，这些特性使circRNA有望成为心肌缺血再灌注损伤理想的生物标志物和潜在的治疗靶点。心肌缺血再灌注损伤的病理机制目前仍不完全清楚，且缺乏有效的防治方法，而circRNA在心肌缺血再灌注损伤方面的研究还处于初始阶段。由于circRNA表达谱在心肌缺血再灌注过程中发生变化，且circRNA功能复杂多样，因此哪些circRNA在心肌缺血再灌注损伤中起关键作用目前尚未可知。未来仍需进一步探索circRNA在心肌缺血再灌注损伤中的病理机制以及circRNA的调控机制，以期为临床上靶向circRNA防治心肌缺血再灌注损伤提供理论依据。