氧化应激介导的细胞凋亡在阿尔茨海默病中的作用

张立敏，顾超，安红梅

(上海中医药大学附属龙华医院脑病科，上海 200032)

随着年龄的增长，阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的患病率逐年升高，给患者家庭和社会带来沉重的经济负担。AD的主要病理特征是β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积形成的老年斑和高磷酸化Tau蛋白形成的神经元纤维缠结，最终导致神经元和突触丢失，尽管AD中神经变性的发病机制有待进一步阐明，但与年龄相关的氧化应激损伤是AD早期发生、发展的核心因素[1-2]。氧化应激作为一种级联反应，由氧化和抗氧化系统不平衡导致，其特征是机体内活性氧类(reactive oxygen species，ROS)、活性氮类(reactive nitrogen species，RNS)等自由基的显著升高；机体代谢过程中不断产生自由基，而抗氧化酶、抗氧化蛋白通过清除自由基维持氧化还原平衡[3]。脑作为高耗氧器官，其抗氧化能力较弱，易发生氧化应激损伤。在AD疾病早期，神经元内异常聚集的Aβ和磷酸化Tau蛋白可作为ROS的效应分子逐渐沉积[4]；异常沉积的Aβ和Tau蛋白导致二价铁离子、铜离子等过渡金属离子增加和线粒体功能障碍，氧化还原失衡所致的ROS增加、抗氧化酶活性改变以及各种凋亡信号通路的相互影响均可导致神经细胞凋亡，加速AD的发生[5-6]。现就氧化应激介导的细胞凋亡在AD中的作用予以综述。

1 线粒体介导细胞凋亡在AD中的作用

线粒体不仅是细胞能量代谢的中心，也是氧化还原反应的主要场所，线粒体氧化损伤和ROS的相互作用是AD病理损伤的因素。AD患者脑中神经元细胞色素C(cytochrome C，Cytc)氧化酶活性降低、ATP生成减少、ROS含量增加，线粒体通道中的淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)累积，随着神经细胞线粒体损伤的加重，AD的严重程度增加[7]。另外，APP/PS1转基因小鼠模型中检测出60个线粒体相关蛋白表达改变，这些蛋白大多参与了线粒体电子传递、三羧酸循环及氧化应激，与神经元凋亡密切相关[8]。采用Aβ孵育人骨髓神经母细胞或过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)孵育PC12细胞，均可诱导ROS生成和线粒体功能障碍，进而导致蛋白质脂质过氧化和DNA氧化损伤，最终导致神经突触丢失、细胞凋亡[9-10]。因此，明确线粒体氧化应激损伤介导的神经细胞凋亡，可以为AD的早期预防和治疗提供依据。

1.1Cytc Cytc是细胞呼吸链中重要的电子传递体，主要存在于线粒体中。研究显示，当神经细胞发生氧化应激时，线粒体膜电位下降、Cytc释放增多、神经突触丢失、细胞凋亡；而加入ROS阻断剂N-乙酰半胱氨酸则可显著抑制细胞内线粒体膜电位下降，减少Cytc释放以及胱天蛋白酶(caspase)3生成，降低细胞凋亡率[11-12]。神经细胞凋亡途径与其他细胞大致相同，即氧化应激损伤时线粒体呼吸链能量代谢障碍，导致线粒体通透性转变孔(mitochondrial permeablity transition pore，MPTP)不可逆开放，位于线粒体内的Cytc释放并与凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptosis protease-activating factor-1，Apaf-1)形成多聚复合体，活化caspase-9 前体，进而激活下游的caspase-3，启动细胞凋亡级联反应[13]。

Aβ作为AD的病理产物，极易损伤胞内神经元线粒体，诱发氧化应激，介导细胞凋亡。Aβ由39～42个氨基酸组成，来源于APP的淀粉样水解途径，APP的胞外区首先被β-分泌酶水解，然后在膜双分子层内Aβ的40或42位氨基酸被γ-分泌酶水解，生成Aβ40或Aβ42[14]。胞内神经元生成的Aβ聚集形成寡聚物，与线粒体外膜转运酶结合而被内吞，从而抑制线粒体呼吸链电子传递和能量代谢，降低细胞色素氧化酶和丙酮酸脱氢酶活性，干扰线粒体裂变和融合，导致胞内谷氨酸和钙离子(Ca2+)转运障碍以及线粒体氧化损伤，释放大量的ROS，最终致蛋白质脂质过氧化、DNA损伤[15-16]。此外，受损的线粒体MPTP不可逆开放，导致线粒体膜电位下降，而位于线粒体内的Cytc等促凋亡蛋白释放进入细胞质中，启动神经元凋亡级联反应[17]。

1.2B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因 Bcl-2位于线粒体膜上，参与调控神经细胞凋亡，其中Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X-protein，Bax)与线粒体的氧化和抗氧化作用密切相关。一方面，Bcl-2是线粒体上MPTP的组成蛋白，可维持正常的线粒体膜电位，抑制pH异常条件下离子通道的形成；另一方面，线粒体上的Bcl-2与Bax结合，封闭Bax形成的孔道的活性，使一些小分子不能通过线粒体外膜进入细胞质，从而起到细胞保护作用[18]。Bax与Bcl-2的作用相反，氧化损伤时下调的Bcl-2不能拮抗Bax形成的孔道的活性，使Cytc、Apaf-1等小分子自由透过线粒体膜，诱导神经细胞凋亡[19]。在应用Aβ或H2O2孵育的PC12细胞中，Cytc和Bax表达上调、Bal-2表达下调，导致神经元凋亡，其凋亡机制与细胞内ROS积累激活Bax、抑制Bal-2活性以及促使Cytc、Apaf-1等促凋亡蛋白释放有关[20-21]。

神经突触周围有大量线粒体，提供神经递质传递和Ca2+流入所需的能量，线粒体极易受到聚集Aβ损伤，导致线粒体电子传递和能量代谢障碍、细胞内Ca2+失衡、大量ROS生成，加速Aβ和Tau的病理学作用；同时，逐渐沉积的Aβ和磷酸化的Tau蛋白进一步加剧线粒体损伤，导致线粒体膜电位下降、Bal-2活性受到抑制、MPTP不可逆开放，Cytc、Apaf-1和Bax等促凋亡蛋白释放进入细胞质中，激活caspase途径，造成神经元和突触丢失，进而导致认知障碍和记忆丧失，参与AD的发病[22]，见图1。

2 ROS-凋亡信号调节激酶1-c-Jun氨基端激酶/p38信号通路介导的细胞凋亡在AD中的作用

ROS作为细胞内氧化应激的效应分子，可引起凋亡相关蛋白的表达，促使信号通路转导变化。其中，ROS-凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)-c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/p38信号通路的激活与ROS相互作用，加速了神经细胞凋亡和突触丢失[23-24]。促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是广泛表达的丝氨酸/酪氨酸激酶，主要包含胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase，ERK)、JNK和p38 MAPK三个家族，ROS触发的级联反应依次通过MAPK激酶激酶-MAPK激酶-MAPK通路将细胞外信号转导至细胞核内，诱导凋亡。

2.1ASK1 ASK1是MAPK激酶激酶家族成员之一，其结构相对保守，在炎症、缺血和氧化应激损伤导致的细胞凋亡通路活化过程中起桥梁作用。神经细胞氧化应激损伤时，过量的ROS、沉积的Aβ均可磷酸化ASK1的苏氨酸残基，磷酸化后的ASK1作为MAPK信号转导所致神经毒性的上游，启动细胞凋亡途径[25-26]。人和鼠的苏氨酸残基分别是Thr-838和Thr-845，高表达的磷酸化ASK1激活下游的JNK/p38，通过p53磷酸化诱导细胞核凋亡靶基因的表达；磷酸化的ASK1还可通过活化线粒体相关Bax的表达及caspase-3途径诱导神经细胞凋亡，参与AD的发病和进展[27]。

2.2JNK/p38 JNK和p38同属应激活化蛋白激酶。JNK由JNK1、JNK2和JNK3基因编码形成，编码后的JNK1/JNK2蛋白在全身广泛表达，而JNK3则主要表达于神经系统。在AD的小鼠动物模型以及大鼠神经元和人成纤维细胞体外细胞模型中，活化的JNK均参与了磷酸化Tau蛋白的形成，加速了AD的发病[28]。在H2O2诱导的PC12细胞和人神经母细胞瘤氧化应激损伤中，磷酸化的JNK和p38 MAPK的表达上调可导致细胞凋亡[29]。ASK1-JNK通路促进细胞凋亡的机制主要包括：①通过调节线粒体和胞质内的蛋白介导细胞凋亡，如活化Bax等促凋亡蛋白的表达并经caspase途径诱导神经元凋亡[30]。在PC12细胞中加入ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸可导致磷酸化JNK表达下调、caspase-3表达减少，H2O2诱导的细胞凋亡率降低[31]。②磷酸化的JNK可以由细胞质转移至细胞核中，促使核内转录因子上调，如通过磷酸化p53、c-Jun、c-Fos诱导下游相关凋亡靶基因的表达，上调FasL、肿瘤坏死因子等死亡分子受体的表达[32]。p38与JNK激活及凋亡的机制大致相同，活化后的p38与JNK又可刺激产生大量ROS，形成ROS、MAPK与caspase间相互作用的正反馈机制，从而加速AD的进展[33]，见图1。

2.3ERK1/2 ERK1/2也是MAPK家族成员，当内环境改变(缺血、氧化、钙积累等)时，ERK1/2磷酸化导致下游蛋白表达改变，参与细胞增殖、分化及凋亡的调控[34-35]。在H2O2诱导的氧化损伤的环境中，磷酸化ERK1/2表达上调可导致胞内caspase-3水平升高，进而致细胞凋亡[36]。APP/PS1转基因小鼠神经元以及AD大鼠模型海马神经细胞中ERK1/2、p38磷酸化表达上调，神经元丢失[37]。由此推测，活化的ERK1/2主要参与AD发病以及氧化应激损伤状态下神经元凋亡的调控，但其调控机制与p38和JNK的凋亡通路是否相同，还有待进一步验证。

3 酶类抗氧化系统介导的细胞凋亡在AD中的作用

酶类抗氧化系统是体内对抗ROS的第一道防线，AD患者脑内谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)活性降低，且伴随大量蛋白质、脂质过氧化，最终导致细胞凋亡[38]。抗氧化系统功能失衡参与了AD的氧化应激损伤以及神经元、突触丢失。

3.1抗氧化酶

3.1.1SOD SOD作为机体内清除超氧阴离子的酶，主要分布于线粒体和细胞质中，SOD通过歧化反应将胞内的超氧阴离子生成H2O2和O2。生理情况下，生成的H2O2可以在GPx、CAT等作用下形成H2O和O2，防止胞内H2O2水平过高对机体造成损伤；当氧化损伤发生时，SOD活性受到抑制，生成的H2O2不能被及时清除，通过细胞膜和线粒体与二价铁离子等其他过渡金属反应形成毒性更大的羟基，加重氧化应激损伤[39]。SOD在AD发生过程中起保护作用，当小鼠的SOD2基因被敲除时，脑内核酸出现氧化损伤；同样，SOD缺乏使Aβ水平升高，促使转基因小鼠痴呆的发生[40]。因此，当神经系统受损时，SOD活性可作为氧化应激损伤程度的重要评价指标。

3.1.2GPx GPx主要分布于线粒体和细胞质中，其不仅可以利用还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)作为底物催化H2O2生成H2O，还可以清除脂质过氧化物。GSH作为GPx的底物主要参与过氧化物的清除，GSH具有抗氧化性可以清除胞内自由基和一些过氧化物。GR通过将氧化型GSH还原成GSH，维持GSH的动态平衡，其中氧化型GSH水平是决定ROS、RNS介导的神经元损伤的关键因素，体内氧化型GSH水平的降低需要多种抗氧化酶的参与，以维持GSH/氧化型GSH的比例；在严重氧化应激条件下，细胞不能维持适当的GSH/氧化型GSH比例，导致氧化型GSH积累，蛋白质、脂质过氧化修饰[41]。细胞质内GSH是维持质膜完整性和突触体中ATP水平的关键，GSH减少导致细胞内ROS、RNS水平升高，H2O2清除减弱，羟基形成增多，进而触发氧化应激，导致神经突触丢失[42]。在H2O2诱导损伤的PC12细胞内，SOD、CAT、GPx、GR活性降低，丙二醛(malondialdehyde，MDA)生成增加，导致细胞凋亡[43]。

3.2脂质、蛋白质过氧化 随着氧化应激的发生，胞内逐渐堆积的ROS、RNS可抑制抗氧化酶活性，导致胞内大分子蛋白质、脂质过氧化，使蛋白质、脂质出现结构和功能障碍。MDA是细胞内脂质氧化的分解产物，而8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG)是DNA分子中鸟嘌呤碱基的第8位碳原子被氧化形成的氧化产物，MDA与8-OHdG的积累表明体内抗氧化酶活性改变导致脂质和DNA氧化损伤。研究表明，AD患者脑脊液中氧化修饰的核苷水平升高，尤其是8-OHdG、MDA水平升高导致总抗氧能力降低[44]。在相同饲养条件下，与野生型小鼠相比，AD模型小鼠尿液中的8-OHdG、H2O2、MDA水平显著升高[45]。随着氧化应激损伤的发生，胞内抗氧化酶被过度消耗、抗氧化酶活性受到抑制，氧化与抗氧化失衡，不断堆积的ROS、RNS使蛋白质、脂质发生过氧化、DNA损伤，诱导神经元和突触丢失[46]。SOD、CAT、GPx、GR共同构成了机体的抗氧化防御体系，SOD催化产生的H2O2需要GPx、GR和CAT的及时清除，以防止胞内H2O2积累与超氧阴离子反应生成毒性更大的羟基，而SOD清除超氧阴离子可避免CAT与GPx失活[42,45]。当酶类抗氧化系统失衡时，过氧化物及ROS积累，导致神经元内的蛋白质、脂质过氧化以及DNA损伤，最终导致细胞凋亡。因此，维持抗氧化酶活性及胞内抗氧化动态平衡是预防和治疗AD的关键研究指标。

4 小 结

AD的致病过程是一个多因素、多机制、渐进性的复杂过程，涉及Aβ病理级联、Tau蛋白过度磷酸化、炎症反应、胆碱能缺失以及氧化应激等，其中与年龄相关的氧化损伤积累是AD发病早期的变化之一。ROS作为氧化应激过程中的主要效应分子，可导致蛋白质、脂质过氧化，抑制抗氧化酶的活性，同时可影响线粒体功能，活化caspase-3，还可通过ASK1-JNK/p38信号转导通路诱导神经细胞凋亡，参与AD的发病。目前AD仍无法治愈，临床常应用胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂改善患者症状。因此，寻找有效的治疗手段及药物以减轻大脑氧化应激损伤，早期防治AD、降低AD的发病率和致残率，已成为目前AD的重要研究策略及评价指标。