m6A RNA甲基化修饰在泌尿系统肿瘤中的研究进展

江志成，简文刚，于政一，张诚

(哈尔滨医科大学附属第一医院泌尿外科，哈尔滨 150001)

转录后修饰是许多生理过程和疾病进展中十分重要的调控因素，并已成为生命科学研究的热点。目前经鉴定，在生物体中有超过100种不同类型的转录后RNA化学修饰[1]。在真核生物中，信使RNA(messenger RNA，mRNA)出现了3种类型的RNA修饰：N6-甲基腺苷(N6-methyl-adenosine，m6A)、5-甲基胞嘧啶和N1-甲基腺苷，其中m6A是最常见和最丰富的修饰之一。m6A的修饰调控需要3种类型分子：甲基转移酶、去甲基化酶和甲基化识别蛋白。m6A RNA甲基化修饰几乎参与了RNA调控的各个阶段，影响RNA成熟、转录、定位、翻译和代谢，从而发挥重要的生物学功能，包括神经系统发育、昼夜节律调控、DNA损伤反应、热激反应和肿瘤发生等[2-3]。近年来，随着泌尿系统肿瘤发病率和死亡率的不断上升，现有治疗手段有限，因此需深入了解其发病的内在分子机制及信号通路并确定生物标志物，以早期诊断、预测预后并提供包括个性化靶向治疗在内的治疗指南。m6A调节因子与泌尿系统肿瘤相关信号通路的激活和抑制密切相关。通过检测肿瘤中m6A甲基化水平，确定m6A调控分子和靶基因RNA修饰的关系，有助于认识肿瘤发生发展机制，为患者个体化治疗提供新的治疗策略。现就m6A RNA甲基化修饰在泌尿系统肿瘤中的研究进展予以综述。

1 m6A RNA甲基化修饰

m6A RNA甲基化修饰是以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，通过细胞内甲基转移酶催化，在底物腺嘌呤第6位氮原子上发生的一种甲基化修饰[4]，其最早于20世纪70年代发现，广泛存在于真核生物mRNA、转运RNA、核糖体RNA和非编码RNA中。RNA甲基化(m6A)免疫共沉淀高通量测序技术联合高通量测序用于检测RNA m6A甲基化位点，打破了人们对m6A RNA甲基化修饰认知的局限性。但RNA甲基化(m6A)免疫共沉淀高通量测序技术靶向的RNA片段被限制于100 nt左右，导致无法准确检测单核苷酸改变的甲基化位点等，而光交联辅助m6A测序技术[5]、m6A单碱基分辨率紫外交联沉淀技术[6]的出现，使得RNA m6A甲基化位点的检测更加精准。

参与m6A RNA甲基化修饰的3种酶(甲基转移酶、去甲基化酶、和甲基化识别蛋白)之间相互交联，参与了癌症的发生和进展。其中，多种甲基转移酶构成甲基转移酶复合物(methyltransferase complex，MTC)，催化底物发生m6A RNA甲基化修饰。MTC由甲基转移酶样蛋白(methyltransferase-like protein，METTL)3催化亚基和其他辅助亚基[METTL14、肾母细胞瘤1关联蛋白(wilms tumor 1 associated protein，WTAP)、Vir样m6A甲基转移酶相关蛋白(Vir-like m6A methyltransferase associated protein，VIRMA/KIAA1429)、RNA结合基序蛋白15和ZC3H13(zinc finger CCCH-type containing 13)等]组成[7]。METTL3与METTL14以1∶1的比例形成稳定的复合物，识别底物RRACH(R=A或G，H=A，C或U)序列，诱导m6A修饰RNA[8]。METTL3-METTL14形成的异源二聚体通过WTAP定位于核散斑体，且WTAP招募其他蛋白加入MTC，从而影响m6A RNA甲基化修饰的整体水平，而RNA结合基序蛋白15/15B通过协助METTL3和WTAP结合，将结合的复合物招募到特定的RNA位点发挥作用[9]。ZC3H13通过桥接WTAP和mRNA结合因子Nito来增强m6A RNA甲基化修饰[10]。VIRMA/KIAA1429招募MTC到RNA终止密码子和3′非翻译区附近发生m6A RNA甲基化修饰[11]。此外，METTL16是新发现的甲基转移酶，其催化U6-核小RNA发生m6A甲基化修饰并参与前体RNA的剪接，且METTL16结合位点与METTL3-METTL14甲基化复合物的结合位点没有重叠[12]。因此，m6A甲基转移酶复合物可能还有其他成分。

去甲基化酶的作用是去除RNA发生的m6A甲基化修饰。截至目前，已鉴定出两种哺乳动物m6A去甲基化酶，即脂肪和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity associated protein，FTO)和Alk B同源蛋白5(Alk B homologue 5，ALKBH5)，这两种蛋白主要定位于m6A RNA甲基化修饰被去除的细胞核中。FTO是第一个发现的m6A去甲基化酶，其具有高度保守的催化结构域，最初被发现与人类体重增加和肥胖有关。第二鉴定出的m6A去甲基化酶ALKBH5能够特异性识别m6A标记发生去甲基化。近年学者发现，ALKBH3可能是一种新型的m6A修饰去甲基化酶[13]。他们发现哺乳动物转运RNA的m6A甲基化修饰是ALKBH3的底物，ALKBH3优先作用于转运RNA而不是mRNA或核糖体RNA。

与甲基转移酶和去甲基化酶不同，甲基化识别蛋白的作用是识别RNA发生m6A甲基化修饰甲基化识别蛋白，结合RNA并实现相应的功能，包括YTH(YT521-B homology)家族、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins，IGF2BPs)、真核翻译起始因子3、核内不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，HNRNP)家族。在YTH家族中，YTH结构域是识别m6A的模块，包括YTHDF1～3、YTHDC1～2。虽然YTH家族有十分相似的结构域，但不同的甲基化识别蛋白在m6A RNA甲基化修饰中发挥不同的作用。其中，YTHDF1能选择性地与终止密码子附近的m6A位点结合，并与起始因子相互作用，增强mRNA的翻译和蛋白合成[14]。YTHDF2通过选择性地结合m6A修饰的mRNA，并将其招募到mRNA衰变位点来诱导转录本的降解。YTHDF1和YTHDF2在m6A修饰中发挥相反的作用，而YTHDF3既能够与YTHDF1相互作用增强RNA翻译，也能与YTHDF2联合促进RNA降解[15]。YTHDC1参与RNA的剪接和输出[16]，YTHDC2虽提高了目标RNA的翻译效率，但降低了目标RNA的丰度[17]。研究发现，IGF2BPs蛋白能通过与m6A结合，增强RNA稳定性来促进RNA表达[18]；真核翻译起始因子3能够与mRNA在5′非翻译区发生m6A甲基化修饰的区域结合，进而以不依赖帽的方式促进转录本的翻译[19]；HNRNPA2B1能够介导目标RNA的选择性剪接，并与DGCR8(DiGeorge syndrome critical region 8)蛋白相互作用增强初级微RNA(microRNA，miRNA)加工[20]，而HNRNPC能参与前体mRNA的加工[21]。可见，m6A修饰与RNA识别蛋白之间复杂的相互作用可能在多个水平调控mRNA的表达。

2 m6A RNA甲基化修饰与泌尿系统肿瘤

科学工作者对m6A RNA甲基化修饰及其分子功能的研究已经扩展到许多人类疾病，特别是m6A介导的基因表达调控在癌症中的作用。通常许多不同的信号通路汇聚到翻译机制上，以满足癌症增加的合成代谢需求。鉴于m6A RNA甲基化修饰在mRNA代谢调控中的作用，可推测其在人类癌变中发挥重要作用。但关于m6A RNA甲基化修饰如何影响癌症细胞表型仍在研究中。现分别介绍m6A RNA甲基化修饰的生物学功能及m6A调控蛋白在泌尿系统肿瘤(肾癌、膀胱癌、前列腺癌和睾丸癌)中的潜在分子机制。

2.1肾癌 肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是男性和女性最常见的肿瘤之一，分别在恶性肿瘤中占5%和3%[22]，其中肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是RCC最常见的组织学亚型，约占70%[23]。大部分肾癌在早期通过手术切除可以得到治愈。然而肾癌对化疗和放疗高度耐药，复发性肾癌或转移性肾癌除能够手术切除局限性病灶外，尚无有效治疗方法。

生物信息学分析显示，5个m6A相关基因(ZC3H13、METTL14、YTHDF2、YTHDF3和HNRNPA2B1)在肿瘤组织中表达显著下调，7个调控因子(YTHDC2、FTO、WTAP、METTL3、ALKBH5、RNA结合基序蛋白15和KIAA1429)在ccRCC中表达显著上调[24]。因此，m6A甲基化调节因子可作为ccRCC患者预后分层的潜在生物标志物，并可帮助临床医师对该患者群体实现个体化治疗。Zhou等[25]研究发现，甲基转移酶基因的缺失和去甲基化酶基因的拷贝数增加使得m6A水平降低，这与ccRCC患者较差的临床特征(包括生存率)存在明显关系。另外，m6A调控基因的改变与VHL(Von Hippel-Lindau)、肿瘤蛋白p53的突变显著相关；METTL3的低表达与脂肪形成和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路的激活有关。Li等[26]证明，敲减METTL3基因会导致磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路磷酸化水平升高影响RCC的进展。METTL3的下调会促进细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间充质转化，诱导G0/G1期阻滞、促进p21表达增加，从而促进RCC肿瘤的生长。MTC的另一关键酶METTL14可通过m6A甲基化修饰P2RX6(P2X purinoceptor 6)mRNA，抑制其蛋白翻译，介导ATP-P2RX6信号轴，改变Ca2+内流，抑制磷酸化胞外信号调节激酶1/2-基质金属蛋白酶9信号通路，阻止RCC细胞的迁移和侵袭[27]。此外，人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因和真核翻译起始因子3A的表达均与METTL14呈正相关[28]。METTL3-METTL14异源二聚体定位的关键酶WTAP在RCC肿瘤组织中表达上调，并与肿瘤大小、TNM分期以及患者预后相关[29]。且WTAP可以与细胞周期蛋白依赖性激酶2 mRNA 3′非翻译区结合并稳定细胞周期蛋白依赖性激酶2转录本，提高细胞周期蛋白依赖性激酶2的表达，从而促进RCC细胞增殖。以上结果均表明，MTC中几种关键甲基转移酶在肾癌的发生发展中起重要的调控作用。

去甲基化酶FTO的低表达与肿瘤严重程度的增加和患者生存率降低有关[30]。过表达FTO能降低过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α mRNA的m6A水平、增强过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α mRNA的稳定性，使其表达增加，恢复VHL缺陷细胞线粒体活性，诱导氧化应激和活性氧类的产生，从而使肿瘤生长受限。研究发现，VHL和FTO在肾癌中能协同发挥致死作用，即抑制FTO能以不依赖缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)的方式抑制VHL缺陷细胞的生长和存活[31]。这为研究m6A RNA甲基化修饰在肾癌中的作用提供了新方向。然而，另一种常见的去甲基化酶ALKBH5在肾癌组织中被检测上调，并与患者的不良预后密切相关[32]。实验表明，ALKBH5以依赖m6A的方式促进了Aurora激酶B mRNA发生去甲基化，增强了其稳定性，促进肾癌细胞增殖、侵袭和转移，且缺氧诱导的HIF可以上调Aurora激酶B和ALKBH5的表达[32]。这表明，虽然FTO和ALKBH5的作用均使得RNA发生去甲基化，但它们在肾癌中的表达水平不同，靶向的RNA也不同，为m6A相关通路在肾癌中的研究提供了多种思路。Green等[33]将RNA的m6A甲基化修饰与RCC肿瘤细胞的代谢状态联系起来，发现线粒体单碳代谢酶MTHFD2能促进HIF-2 mRNA的m6A甲基化，导致HIF-2翻译增强、表达增多，促进有氧糖酵解，MTHFD2和HIF-2在RCC中形成正反馈环，促进肿瘤的代谢和生长。因此，m6A修饰能够通过不同的甲基化酶和去甲基化酶，调节不同目标靶基因RNA发生甲基化或去甲基化修饰，进而影响其稳定性并作用于下游通路，从而调节肾癌的发生发展，为肾癌的靶向治疗提供新思路。

2.2膀胱癌 膀胱癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，其中移行细胞癌最为常见，占所有膀胱癌的90%以上[34]。根据肿瘤侵袭浸润程度，膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌。非肌层浸润性膀胱癌约占膀胱癌的75%，且10%～30%的非肌层浸润性膀胱癌可进展为肌层浸润性膀胱癌，肌层浸润性膀胱癌的恶性程度较高，复发率较高，总体预后较差[34]。

膀胱癌患者的术后复发风险差异较大，部分患者复发风险较高。生物信息学分析显示，包括METTL3在内的9个突变基因与膀胱癌复发呈显著负相关[35]。这一发现可能有助于临床辅助治疗决策，对患者进行个体化监测以降低复发风险。研究发现，MTC的催化亚基METTL3在膀胱癌肿瘤组织中表达上调，且与膀胱癌的进展状态相关[36]。体内利用化学致癌物促进尿上皮细胞的恶性转化实验和体外细胞实验证实，METTL3催化了CUB结构域蛋白1(CUB domain-containing protein 1，CDCP1)mRNA上3′非翻译区发生m6A修饰，增强YTHDF1与CDCP1 mRNA的结合，促进CDCP1 mRNA的修饰和翻译[36]。同时，ALKBH5可以去甲基化CDCP1 mRNA，负向调控CDCP1蛋白表达。类似的作用在ITGA6 mRNA中也得到证实，且YTHDF1/YTHDF3能够优先识别ITGA6 3′非翻译区中的m6A修饰区域，促进ITGA6翻译，增强膀胱癌细胞的生长和转移能力[37]。METTL3还可以通过与微处理器蛋白DGCR8相互作用，增强对前体miR-221/222的识别和结合，并以m6A依赖的方式加速前体miR-221/222的成熟，减少人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因的表达，从而在膀胱癌中发挥致癌作用[38]。且METTL3能直接介导AF4/FMR2家族成员4(AF4/FMR2 family member 4，AFF4)、核因子κB通路的两个关键调节因子[核因子κB激酶亚单位β抑制剂(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit beta，IKBKB)和转录因子p65]和骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物(myelocytomatosis viral oncogene homolog，MYC)的m6A RNA甲基化修饰，促进膀胱癌的进展[39]。这在另一项研究中也得到证实，即METTL3-AFF4-SOX2(SRY-box transcription factor 2)/MYC信号轴通过m6A修饰参与维持膀胱癌干细胞的干性[40]。此外，AFF4可直接与MYC启动子结合，促进其表达，表明METTL3下游有十分复杂的多级调控网络[39]。研究发现，METTL3催化肿瘤抑制因子SETD7和Krueppel样因子4 mRNA发生m6A修饰，YTHDF2对其进行识别，导致mRNA的衰变，促进膀胱癌进展[41]。MTC另一关键酶METTL14的表达水平在膀胱癌和膀胱肿瘤起始细胞中下降，并与临床严重程度和预后相关[42]。METTL14以m6A RNA甲基化修饰方式靶向Notch1 mRNA稳定性抑制肿瘤发生和膀胱肿瘤起始细胞的自我更新能力，这可能成为消除膀胱肿瘤起始细胞的潜在靶点。上述研究表明，m6A甲基化酶METTL3和METTL4在膀胱癌中发挥十分重要的作用，而其他甲基化酶及去甲基化酶在膀胱癌中的作用尚不清楚。

2.3前列腺癌 前列腺癌是全球男性最主要的恶性肿瘤，对于晚期前列腺癌，特别是转移性前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌，目前尚无绝对有效的治疗方法[43]。生物信息学分析显示，前列腺癌患者肿瘤与正常标本中m6A RNA甲基化调节因子的mRNA表达水平存在差异，50%的m6A甲基化识别蛋白和甲基转移酶在肿瘤标本中高表达，而FTO、ALKBH5在肿瘤标本中低表达[44]。该研究进一步通过单变量和多变量Cox回归分析发现，IGF2BP3、HNRNPA2B1、METTL14和ALKBH5与前列腺癌患者的无复发生存率显著相关。说明mRNA中高水平的m6A甲基化，影响蛋白亚细胞定位，促进前列腺癌的进展，使得患者生存获益较差。MTC的催化亚基METTL3在前列腺癌肿瘤组织中表达上调，它能促进癌细胞的增殖和侵袭，这一调控作用依赖于METTL3 m6A的催化活性；进一步的机制分析表明，METTL3通过m6A修饰GLI1 mRNA，介导SHH(Sonic hedgehog)-GLI通路调控前列腺癌细胞凋亡[45]。且METTL3也能促进淋巴增强子结合因子1(lymphoid enhancer-binding factor 1，LEF1)mRNA的m6A甲基化，使得LEF1在前列腺癌中表达上调[46]。同时IGF2BP2与m6A修饰的LEF1 mRNA相互作用，延长了LEF1 mRNA的半衰期，从而上调LEF1蛋白水平。METTL3-LEF1信号轴影响Wnt通路的活性，进而促进前列腺癌的进展。另一项研究表明，METTL3能提高ITGB1 mRNA的稳定性，使得ITGB1表达增加，从而增强前列腺癌细胞对Ⅰ型胶原的黏附性和迁移能力，促进癌细胞的骨转移[47]。同时，METTL3-m6A依赖性机制也能调控HuR基因介导的ITGB1 mRNA的稳定性。且METTL3还能通过m6A甲基化修饰与MYC mRNA相互作用，调控MYC表达，促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[48]。这些结果均表明，METTL3可能是人类前列腺癌的一个潜在预后生物标志物。

甲基化识别蛋白YTHDF2在前列腺癌组织和细胞系中表达均上调，且过表达YTHDF2会显著抑制整体m6A甲基化，促进前列腺癌细胞的增殖和迁移[49]。此外，miR-493-3p能够直接靶向YTHDF2。进一步试验证实，YTHDF2的表达会被miR-493-3p抑制，进而抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移[49]。鉴于此，METTL3-YTHDF2对RNA的作用也被证实，METTL3能够促进前列腺癌肿瘤组织中LHPP(phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase)和NKX3-1(homeobox protein Nkx-3.1)发生m6A RNA甲基化修饰，随后被YTHDF2识别并降解，进而激活下游通路蛋白激酶B的磷酸化[50]。因此，m6A修饰为前列腺癌的致癌作用和新的潜在治疗靶点提供了新视角，但对m6A其他甲基转移酶和去甲基化酶在前列腺癌中的作用研究较少。

2.4睾丸癌 睾丸癌约占全球男性癌症的1%，是年轻人(15～40岁)最常见的实体瘤，其发病率呈上升趋势[43]。睾丸生殖细胞瘤(testicular germ cell tumors，TGCTs)是睾丸癌患者的主要组织学类型，约占95%，其又分为精原细胞瘤和非精原细胞瘤，其中精原细胞瘤较非精原细胞瘤略常见。

生物信息学分析显示，VIRMA/KIAA1429和YTHDF3是TGCTs中最常改变的两个m6A相关基因，分别占52%和48%[51]。它们在TGCTs亚型中表达不同，与非精原细胞瘤相比，VIRMA/KIAA1429和YTHDF3在精原细胞瘤中显著过表达，且两者呈正相关，这可能为患者管理提供新的候选生物标志物，从而进一步阐明TGCTs的生物学和临床行为。研究发现，MTC催化亚基METTL3和甲基化识别蛋白IGF2BP1在精原细胞瘤中通过转录因子激活增强TFAP2C发生m6A甲基化，从而抵抗顺铂治疗的耐药性[52]。这为精原细胞瘤患者增强化疗疗效提供可能的靶点。然而与其他泌尿系统肿瘤相比，m6A RNA甲基化修饰在睾丸癌中的研究十分有限，为阐明其发生发展的分子机制及指导未来的临床治疗还需进一步的研究。

3 结 语

研究m6A RNA甲基化修饰在泌尿系统肿瘤中的作用，有助于揭示肿瘤发生内在分子机制，对早期诊断、治疗以及指导预后具有重要意义。MTC中关键亚基METTL3在肾癌、膀胱癌、前列腺癌和睾丸癌中均发挥重要的调控作用，而甲基转移酶METTL14和WTAP的作用也不容忽视。去甲基化酶FTO和ALKBH5发挥与甲基转移酶相互拮抗的作用，对肿瘤进展也十分关键。然而，m6A RNA甲基化修饰其他分子尤其是甲基化识别蛋白在泌尿系统肿瘤中的分子机制和细胞效应尚不完全清楚，且不同或相同的甲基转移酶或去甲基化酶并不总是以相同的方式发挥作用。同时，m6A RNA甲基化修饰调控分子在泌尿系统肿瘤中的异常表达机制也尚不清楚，因此需要开发新的基于m6A RNA甲基化修饰调控的肿瘤治疗方法，需要对每种泌尿系统肿瘤类型以及不同病理分型进行更深入的研究。