Wnt信号转导通路在心肌肥厚中作用的研究进展

董建婷，王琼英，牟玉苹，陈鑫，余静

(兰州大学第二医院高血压中心，兰州 730000)

心肌肥厚是心肌细胞在长期压力负荷下的一种适应性反应，以维持心脏后负荷持续增加时的心脏收缩功能，其基本细胞形态学改变及病理改变为心肌细胞肥大。然而，病理性心肌肥厚与心室重构有关，心肌肥厚是心血管事件有力的、独立的心血管事件预测因子，其与高血压、心房颤动、室性心动过速/心室颤动、心脏性猝死及新发痴呆/认知障碍等疾病的发生率增加有关[1]。目前心肌肥厚的发病机制尚不明确，可能与心肌肥厚相关的细胞信号转导通路[AMP活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白C1/自噬通路、胞外信号调节激酶通路、靶向沉默转化生长因子-β激活激酶1-p38 促分裂原活化的蛋白激酶/c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)1/2信号通路、钙调磷酸酶/活化T细胞因子c3通路等]有关[2-3]。

Wnt信号转导通路是生物体内一条高度保守的信号通路，能够调节体内多种生理和病理过程，具有广泛的生物学意义。Wnt信号转导通路是目前公认的调控胚胎心脏发育的主要信号通路之一。在胚胎发育早期，Wnt信号转导通路被激活并促进心脏原基形成；在胚胎发育晚期，该通路下调以维持正常心脏的基本形态与结构；在成人正常心肌细胞中，其表达完全沉默[4]。成人心肌细胞中Wnt信号转导通路的异常激活可导致心肌肥厚的发生，故该通路可能在心肌肥厚发生发展中发挥重要作用。目前临床上尚无关于通过Wnt信号转导通路靶向治疗心肌肥厚的报道，现对Wnt信号转导通路各分子信号组成在心肌肥厚发生中的具体机制及作用予以综述，探讨心肌肥厚治疗的可能靶点，以期为心肌肥厚的治疗提供思路。

1 Wnt信号转导通路

1.1组成 Wnt基因在1982年首次发现于小鼠乳腺癌中，曾被称为Int-1的原癌基因，随后发现其与果蝇中的Wingless基因同源，故称为 Wnt基因[5]。目前研究发现，哺乳动物体内的Wnt是由19个Wnt亲脂蛋白组成的家族，分子量为39 000～46 000，经过广泛的翻译后修饰，以生物活性形式分泌[6]。根据作用将其分为Wnt1类和Wnt5a类。Wnt1类又称经典Wnt蛋白，包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8和Wnt8a，主要参与经典Wnt信号转导通路，在细胞的形成、分化、增殖、凋亡中起关键作用。Wnt5a类又称非经典Wnt蛋白，包括Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a和Wnt11，主要参与非经典Wnt信号转导通路，在维持细胞内Ca2+水平、细胞极性的建立、细胞骨架重建中发挥重要作用[7]。根据信号的不同，Wnt信号转导通路分为经典的Wnt/β联蛋白(β-catenin)信号转导通路与非经典的Wnt信号转导通路，后者又包括Wnt/Ca2+信号通路和Wnt/平面细胞极性(the planar cell polarity，PCP)通路。

1.2作用机制 Wnt/β-catenin信号转导通路通过多种组成成分发挥作用，包括卷曲蛋白(Frizzled，Fzd)、低密度脂蛋白受体相关蛋白(lipoprotein-related receptor protein，LRP)5/6、β-catenin、散乱蛋白(Disheveled，Dvl)、体轴抑制蛋白、糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase，GSK)3β、结肠腺瘤性息肉病蛋白、酪蛋白激酶Ⅰ以及下游蛋白T细胞因子(T-cell factor，Tcf)/淋巴样增强因子(lymphoid enhancer factor，Lef)等。Wnt/β-catenin信号通路通过以下机制发生作用[5]，无Wnt配体时，体轴抑制蛋白、结肠腺瘤性息肉病蛋白、GSK-3β、酪蛋白激酶1a和β-catenin在细胞质中形成β-catenin降解复合物，磷酸化β-catenin，使其被泛素蛋白酶体靶向降解，细胞核内的转录因子Tcf/Lef与Grouch结合，使下游靶基因的激活沉默；当Wnt配体存在时，Wnt信号转导通路被激活，细胞膜上形成由Wnt配体、Fzd和LRP5/6组成的受体复合物，胞质内的Dvl被招募并与该受体复合物的胞内区结合，Dvl被磷酸化激活后结合β-catenin降解复合物，这一过程抑制了β-catenin的磷酸化，使β-catenin从降解复合物分离，稳定并聚集后进入细胞核，与转录因子Tcf/Lef结合，进一步激活Wnt信号传导通路下游靶基因(如c-myc、c-fos、细胞周期蛋白D1等)的转录及表达。

在Wnt/Ca2+信号通路中，Ca2+是最核心的第二信使，由其介导的Fzd信号转导通路可调节肌肉收缩并激活蛋白激酶C和基因转录等过程，对细胞内Ca2+水平的平衡起重要作用。在胚胎生长发育过程中，细胞通过增殖和分化发育为不同的器官和组织，PCP通路被认为是维持该过程稳定性的机制之一，如参与神经管的形成；PCP的信号因子通过Fzd/Dvl复合物发挥作用，诱导细胞骨架重建，并建立细胞极性平衡[8]。

2 经典Wnt/β-catenin信号转导通路各组成与心肌肥厚

2.1Wnt/β-catenin信号转导通路上游分子与心肌肥厚 Wnt/β-catenin信号通路的上游分子主要包括膜受体Fzd、LRP5/6及Dvl，此外，Wnt信号转导通路拮抗分子分泌型Fzd相关蛋白(secreted fizzled related protein，sFRP)也在此水平发挥作用。

Fzd由七个跨膜受体组成，属于Wnt蛋白的受体，目前已在哺乳动物中发现10种不同的Fzd，不同Fzd激活不同的Wnt通路：部分Fzd与Wnt蛋白结合后可激活Dvl信号，抑制GSK-3β的活性，从而激活经典Wnt通路；而有些Fzd通过介导胞内Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶 Ⅱ 以及蛋白激酶C激活非经典Wnt通路[9]。Fzd的N端具有独特的胞外区域，其中由10个高度保守的半胱氨酸残基形成的5个二硫键决定了其三维形状，这种富含半胱氨酸的结构域被认为是Fzd与Wnt蛋白相互作用的位点[10]。Cerutti等[11]通过不同高血压/肥厚动物模型[包括自发性高血压大鼠、里昂高血压大鼠和杂合子TGR9(mREN2)27大鼠]观察到Fzd2参与了心肌肥厚的发展，证实Fzd2的表达与大鼠左心室质量指数呈正相关。但目前关于Wnt-Fzd的具体相互作用尚无全面研究，仍需进行大量动物实验。

Fzd蛋白与Wnt蛋白结合后，还需要结合LRP5和LRP6才能激活Wnt信号通路，LRP5和LRP6均超过1 600个氨基酸，其细胞外结构在信号转导控制中起重要的调节作用，而其细胞内区域包含多个磷酸化位点，其磷酸化是启动信号转导的关键步骤[12]。Alapati等[13]在高氧诱导的新生儿肺损伤小鼠模型中证实，LRP5/6与肺动脉高压及心室肥大呈正相关；缺氧性新生儿通常会发生肺损伤，引起肺动脉高血压，可能进一步导致右心室肥大，上述改变均与Wnt/β-catenin信号转导通路的激活有关；当通过Wnt-LRP5/6复合阻滞剂——Mesd抑制Wnt信号转导后，肺动脉高压和右心室肥大较前减轻，证实了阻断LRP5/6可产生抗心室心肌肥厚的作用。

Dvl蛋白是细胞内受体水平Wnt信号转导的重要组成部分，是形成Wnt/Fzd支架复合物的重要中介。目前已发现3个脊椎动物Dvl功能结构域，①Dvl的N端DIX结构域，参与了体轴抑制蛋白与Fzd及LRP5/6的结合，与Wnt/β-catenin信号转导通路有关；②Dvl中间部分的PDZ(Postsynaptic density/Discs large/Zonula occludens)结构域，可与Fzd结合；③Dvl的C端DEP结构域可与PDZ结构域共同参与PCP通路及G蛋白偶联信号通路，与非经典的Wnt信号通路相关[14]。van de Schans等[15]对主动脉带扎术的小鼠模型的研究显示，术后7 d，Dvl1 WT小鼠心肌后壁厚度增加，心肌肥大标志物(心房尿钠肽)和(脑钠肽)的表达水平增加1倍以上，且β-catenin表达上调，经典Wnt通路激活，但术后4周Dvl1 KO小鼠才发生上述变化，表明Dvl1的表达与心肌肥厚有关，Dvl1基因缺失可延迟心肌肥大的发生。Hagenmueller等[16]的研究证实，Dapper-1是Dvl2介导心肌肥大和左心室重构的关键调节因子，过表达Dapper1小鼠心肌细胞横截面积增大，并可诱导肥大标志物心房尿钠肽、脑钠肽和β肌球蛋白重链表达，同时小鼠体内出现Dvl2高表达，证实Dvl蛋白与心肌肥厚存在正相关关系。

目前关于Wnt/Fzd通路的研究主要集中于其拮抗分子——sFRP。sFRP的N端与Fzd富含半胱氨酸的结构域序列具有30%～50%的相似性，类似于Fzd，但因缺乏穿膜区而不能和质膜结合，其主要作用机制是通过清除细胞外Wnt抑制Wnt信号，阻止Wnt与Fzd结合，从而对该通路进行负向调控[17]。然而，在哺乳动物心脏重构和修复中sFRP的作用高度复杂，可能是Wnt通路的激活剂通过形成同质或异质sFRP复合物增加细胞内β-catenin的积累，以利于Wnt信号转导[18]。一项关于野生型小鼠和sFRP-1缺乏小鼠的实验发现，随着实验的进行，sFRP-1基因缺失小鼠的死亡率与野生型小鼠比较差异无统计学意义；但随小鼠月龄的增加，sFRP-1基因缺失小鼠逐渐出现心脏结构异常和功能障碍，除心功能恶化和大量心肌纤维化外，还观察到扩张型心肌病的所有特点；sFRP-1缺失导致老年心脏中Wnt配体(Wnt 1、3、7b和16)、Wnt靶基因Wnt1诱导信号通路蛋白1和Lef1的表达增加，与β-catenin蛋白水平升高有关，提示sFRP-1基因表达下降，可能增加Wnt1诱导信号通路蛋白1及β-catenin在缺血性扩张型心肌病中的表达[19]。

2.2细胞质内β-catenin聚集与心肌肥厚 Wnt/β-catenin信号通路作用机制部分提到，在Wnt信号产生的情况下，细胞质内β-catenin磷酸化被抑制，β-catenin降解复合物分离，使β-catenin在细胞质中稳定并聚集。目前较多研究集中于β-catenin和GSK-3β。

β-catenin是一组分子量在80 000左右的蛋白质，也是Wnt/β-catenin信号通路的核心分子。β-catenin在细胞中有两种不同功能[20]：①β-catenin是钙黏蛋白-联蛋白细胞黏附复合物的一部分；②β-catenin是基因转录的重要调节因子。目前Wnt通路的大量基础实验都集中于β-catenin。β-catenin有多个磷酸化位点，其功能状态由其磷酸化和稳定状态决定。β-catenin信号在体外和体内均可诱导心肌细胞肥大的发生。Lee等[21]的研究证实，急性心肌梗死患者体外心肌细胞以及自发性高血压大鼠心脏组织中均存在β-catenin表达和核易位升高；且β-catenin过表达通过激活胞外信号调节激酶1/2、JNK和p38使心肌细胞发生肥厚性反应。β-catenin在不同心肌肥大实验中的作用不同，Khan等[22]对使用GSK-3β抑制剂CHIR99021缺血再灌注损伤心肌细胞模型的实验发现，河马信号通路的主要信号Yes相关蛋白1与β-catenin在抑制缺血再灌注损伤后细胞肥大的过程中具有协同作用。然而，Baurand等[23]的研究显示，血管紧张素(angiotensin，Ang)Ⅱ灌注2周的β-catenin特异性缺乏小鼠的心肌细胞出现肥大反应，而β-catenin稳定表达小鼠的心肌细胞较基线时的横截面积减小，且未出现AngⅡ所致的肥大反应。上述研究结果的差异可能与不同模型导致心肌细胞的不同反应有关，稳定的β-catenin足以诱导心肌细胞肥大，但其确切作用仍需深入研究。

GSK-3β是一种普遍存在的丝氨酸/苏氨酸激酶，在多种细胞功能中起至关重要的作用，如代谢、基因表达及细胞骨架完整性的维持，主要包括GSK-3α和GSK-3β两个亚型[24]。GSK-3β能够广泛磷酸化底物并抑制其活性，决定性地介导β-catenin依赖和独立的级联反应。在一项试验中，阿司匹林有效逆转了主动脉缩窄小鼠模型和AngⅡ诱导的血管平滑肌肥大模型中的β-catenin上调以及GSK-3β下调，并可抑制心肌肥大的发生，证实GSK-3β在Wnt通路中具有负向调控作用[25]。Zhang等[26]的研究发现，抑制GSK-3β信号有利于保护心肌细胞，但对心肌肥厚不利；在GSK-3β基因敲除小鼠左心室功能明显提高，而未敲除GSK-3β基因小鼠未存活。

2.3Wnt/β-catenin信号转导通路下游分子与心肌肥厚 β-catenin不含DNA结合结构域，因此为了调控基因的表达，稳定并聚集到细胞核中的β-catenin需要与转录因子形成复合物。在细胞核中，β-catenin与Tcf/Lef结合激活Wnt信号靶基转录。Tcf/Lef蛋白属于核蛋白高迁移率族蛋白超家族，是Wnt信号通路的主要下游效应因子[27]。目前研究发现，哺乳动物Tcf/Lef家族包括Tcf7、Lef1、Tcf7L1和Tcf7L2四个核因，也称为Tcf1、Lef1、Tcf3、Tcf4，其中结合Tcf1和Tcf4的β-catenin复合物可以作为下游靶基因的激活剂[28]。Tcf/Lef蛋白与心肌肥厚呈正相关，在AngⅡ诱导的新生大鼠心肌细胞肥大模型中，AngⅡ通过超氧化物歧化酶蛋白激酶B/GSK-3β/β-catenin/Tcf/Lef途径激活诱导Wnt1诱导信号通路蛋白1的表达，Tcf/Lef蛋白的表达增加，而AT1拮抗剂氯沙坦预处理以及敲除Wnt1诱导信号通路蛋白1均可显著抑制该效应[29]。

c-myc是Wnt通路的下游靶基因，属于原癌基因，是调控细胞周期和增殖的主要基因。c-myc与心肌肥厚呈正相关，在1型糖尿病小鼠造模成功4周后，糖尿病组小鼠心肌细胞中β-catenin、心房钠尿肽前体A基因及c-myc表达上调，心肌肥厚发生；而使用β-catenin核转录抑制剂(ICRT 14)小鼠心肌细胞中β-catenin、心房钠尿肽前体A基因及c-myc的表达下调[30]。

几乎所有Wnt信号分支都参与了心肌肥厚的调节。成年雄性C57BL/6J小鼠接受主动脉缩窄术或假手术，在主动脉缩窄手术后4周内每天腹腔注射Wnt信号通路阻滞剂——重楼皂苷Ⅰ，通过超声心动图和组织学分析发现，重楼皂苷Ⅰ减弱了主动脉缩窄引起的心脏肥大，表现为心脏质量降低、心肌细胞横截面积缩小、心脏纤维化减弱以及肥大生物标志物(心房钠尿肽、脑钠肽和β-MHC)降低，且β-catenin/总β-catenin、GSK-3β、c-myc、c-jun、c-fos表达水平降低；此外，重楼皂苷Ⅰ还可改善AngⅡ诱导的体外心肌细胞肥大[31]。

3 非经典Wnt信号转导通路与心肌肥厚

有些Wnt蛋白(包括Wnt1、Wnt5a和Wnt11等)不依赖经典Wnt/β-catenin通路，不产生内源性β-catenin累积信号，而是需要非经典Wnt信号转导通路(如Wnt/Ca2+信号通路和Wnt/PCP信号通路)的参与。非经典通路的激活同样需要激活胞质内Dvl，以募集下游蛋白。

Wnt/Ca2+信号通路主要通过激活Ca2+相关的酶[钙调蛋白依赖激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)、钙调磷酸酶及钙调素等]发挥作用[32]。CaV1.2通道、CaMKⅡ和钙调素调节细胞内Ca2+水平，细胞内Ca2+水平与心肌肥大有关。体内实验显示，异丙肾上腺素刺激可引起SD大鼠心脏及心肌细胞肥大，且CaV 1.2通道在体内和体外模型中的表达无差异，但异丙肾上腺素刺激诱导的CaV 1.2通道活性增加，Ca2+水平升高；异丙肾上腺素组CaMKⅡ和磷酸化CaMKⅡ的表达水平均升高，钙调素表达水平下降，表明心肌肥厚时，细胞内Ca2+水平增加，CaMKⅡ与CaV1.2的结合能力增强，与钙调素相比，CaMKⅡ可能是更重要的逆转心肌肥厚的药物靶点[33]。

在Wnt/PCP途径中，Wnt蛋白与细胞表面的Fzd结合后通过活性氧类/JNK/转录因子ⅡB相关因子1途径激活JNK等的表达，从而辅助细胞骨架组织和基因表达的调控。去氧肾上腺素诱导建立SD大鼠乳鼠心肌细胞肥大模型，去氧肾上腺素剂量依赖地引起心肌细胞内活性氧类的生成增多、JNK活化以及转录因子ⅡB相关因子1表达增多；而JNK抑制剂可抑制JNK的激活，进而抑制心肌细胞肥大[34]；在此研究中，新型钙通道阻滞剂碘化N-正丁基氟哌啶醇可抑制肥大心肌细胞中活性氧类的生成，并抑制JNK的活化，从而拮抗心肌肥厚的发生，因此Wnt/Ca2+信号通路与Wnt/PCP信号通路可能共同参与调节心肌肥厚的发生，但仍需进一步研究的证实。

目前对于非经典Wnt信号转导通路在心肌肥厚发生机制中作用的研究有限，尚不明确其具体调节过程及相互作用，且非经典Wnt信号转导通路与经典Wnt信号转导通路之间的相互作用亦不清楚，需要更多研究的证实。

4 小 结

Wnt信号转导通路与多种生理功能和疾病相关，大量配体、受体参与该通路，可在不同分子水平上对生物体进行调控。目前有关Wnt信号通路中相关分子组成的研究结果尚不一致，如激活GSK-3β可能抑制心肌肥厚或促进心肌细胞凋亡，导致上述结果的原因可能与实验动物模型、干预药物以及其他变量之间的差异有关。此外，几乎所有Wnt/β-catenin信号转导通路的成分都至少在一个非编码RNA调控下表达，其中一些非编码RNA在心肌肥厚中的意义已经被报道[35]。因此，需要更多研究来揭示Wnt信号转导通路中各分子信号参与心肌肥厚的复杂机制及相互调控，以为心肌肥厚的靶向治疗提供新的思路及实验依据。