分子生物学技术应用于病原微生物检测中的价值分析

郑晓华 董锐 白晶 赵宇

（黑龙江省疾病预防控制中心，黑龙江 哈尔滨，150030）

1.病原微生物检测中的常见分子生物学技术

聚合酶链反应(PCR)在生命科学领域中具有广泛的应用价值，它是一种常见的分子生物学技术。它能在体外以体外酶的作用，促进DNA片段的合成，在合成之后，通过DNA双链的延伸，退火变性等一系列的流程，然后是DNA片段，得到快速扩张，扩增之后能达到更好的检测效果，PCR技术简而言之，就是利用DNA片段在高温环境下会变性，恢复常温会再次形成双链的特点，进行检测的技术在体外95摄氏度的温度下变成单链，在60度左右的温度下，又会根据碱基互补的原理形成双链，75摄氏度的环境下是DNA聚合酶的最佳温度，在DNA聚合酶的作用下，它能沿着磷酸的方向转为戊糖(5’-3’)[1]。聚合酶链反应仪实际上是一种温控设备，可以很好地将温度控制在95℃、55℃和72℃之间。荧光定量聚合酶链反应仪有单通道、双通道和多通道，因为单通道一次只能检测一个目标基因的扩增量，需要多次扩增才能检测不同目标基因片段的量。它广泛应用于医学和生物实验室，在类似于遗传病图谱检测传染病的诊断与检测基因复制以及亲子鉴定等方面，PCR技术都有非常广泛的应用，在病原微生物检测中，PCR技术更是成为当下最流行的一种检测技术。

2.PCR技术在病原微生物检测中的作用分析

2.1 研究方法

选取在我院就诊的50例患者作为研究对象。首先选择模拟样本或已知数量值的临床样本进行多次稀释，每个浓度至少重复三次，这样就能获得最低浓度的阳性检测样本，然后绘制标准曲线，获得R^2和扩增效率的信息(一般标准曲线至少要有5个点，qPCR的r^2≥0.99，扩增效率为90%-110%)。然后，在最低检测浓度附近制备几个浓度，并进行20次重复。该方法的灵敏度/最小检测限为19个以上阳性检测的浓度。每名患者要采集两份病原微生物检测样本，一号病原微生物检测样本是实验组，它采用常规的逆转录PCR技术检验二号病原微生物为实验组，它采用实时荧光定量PCR技术进行检测，通过两组的对照与统计，能够比较出两组患者在病原微生物检测中具体的满意度和阳性率。

2.2 研究过程

在无菌环境下，将20种标准菌株接种于相应的培养板上，在合适的温度下培养12-24小时。选择单个菌落，接种在5ml液体培养基中过夜培养。生物信息学方法用于筛选基因序列的保守片段。每种病原体设计有两对引物，共有特异性引物，40对特异性整体片段长度在90 bp到100 bp之间，在实际的检测中，每对引物对目标的菌株基因组模板进行首次PCR，PCR之后的产物，经过电泳检测，一般是在琼脂糖凝胶检测所扩增的产物送到第三方检测机构，然后进行DNA测序检验PCR引物的敏感性，整体上目标菌株的特异性引物用以扩增，引物的特异性通过聚合酶链反应产物中非特异性条带的存在来验证。根据模板混合物中包含的目标，选择两对相应的引物在与阳性对照相同的条件下进行聚合酶链反应，以确认聚合酶链反应是否可以正常进行。通过聚合酶链反应从目标细菌的基因组中获得目标扩增片段。5μl模板用于多重PCR扩增，每个梯度重复3组[2]。

2.3 研究结果

与两组患者的病原微生物检测阳性计算率相比，在实验组患者的病原微生物检测整体的阳性概率为78%，这一数据与实验组相比明显更高一些，而两组患者的病原微生物检测满意程度显然是实验组二更高，实验组二的满意率为94%，而实验组的满意率仅为78%。

与传统的检测方法相比，PCR有三个优点:首先，这种方式的操作相对简单，检测微生物时只需1-2小时即可完成检测，它非常适合于快速检测，且能提升整体的病原微生物检测效率，在突发传染性疾病检测中具有优势检测作用，另外PCR技术的特异性很高，在检测病原微生物时可以准确地检测微生物的种类。最后，灵敏度高，可以达到3个rfu的灵敏度，因此在检测病原微生物中作用是非常明显的，在2020年新冠肺炎期间，PCR技术更是在核酸检测中广泛应用，新冠病毒的结构是由DNA或RNA与外部脂质保护囊结合而成。PCR核酸检测是直接从鼻腔取样检测新冠病毒的DNA。因此，直接检测病毒DNA是最准确、最快、最有效的新冠检测方法。经过多年的研究，PCR技术在猪病相关的疾病诊断和检验中已经具有很高的特异性，且操作方便，易于临床开展，最大程度上节省救治时间，降低救治风险。

3.结语

总而言之，微生物病原体检测中需要技术支持，在实际的应用过程中，PCR技术是常见的且具有较高的应用优势，基于此，更应当加强技术做好相关的规范，才能提升研究效果。