二去水卫矛醇和二乙酰二去水卫矛醇抗肿瘤作用的研究进展*

申雅娟 ，邓楠 ，丁辉 ，张丽娟 ，宋新波 ，杨建会

（1.天津中医药大学，天津 301617；2.天士力集团有限公司，天津 300402）

近年来肿瘤发病率越来越高，但尚未发现十分有效的治疗药物，严重威胁人类健康，所以发现更有效的肿瘤治疗药物尤为重要。二去水卫矛醇（DAG）其化学名称为 1，2∶5，6-二脱水半乳糖醇，是一种活性较好的抗肿瘤药。根据DAG的药物效应动力学及药物代谢动力学特性——对多种肿瘤细胞有较好的抑制作用，又可以透过血脑屏障作用于脑肿瘤，将DAG制成其前体药物以降低其毒性是有必要的。因此学者们合成大量DAG衍生物以探究其抗肿瘤活性，其中应用最广泛的是二乙酰二去水卫矛醇（DADAG）。研究发现在已糖醇中，DADAG的毒性最小；DADAG比DAG脂溶性大，更易透过血脑屏障[1-2]；DADAG对多种肿瘤也有抑制作用。因此本文就DAG和DADAG的合成、抗肿瘤作用及其机制、联合用药进行综述。

1 DAG和DADAG的合成

Shirota等[3]以从卫矛科美登木属植物Maytenus ebenifolia的干燥茎皮分离得到的卫矛醇为原料，在溴酸溶液中进行溴代反应得到二溴卫矛醇（DBD），DBD和碳酸钾在叔丁醇中发生分子内消除反应得到DAG粗品，经重结晶得到DAG纯品，代霖霖等[4]对其工艺进行了优化，最终产品纯度>97.0%，并适合放大生产。赖树生等[5]探索出了工艺操作简单、生产成本低廉的DADAG合成方法，其纯度达到了99.1%。

2 DAG和DADAG的抗肿瘤作用

关于DAG和DADAG的抗肿瘤作用，运用最早的是治疗白血病。20世纪初，国内治疗慢性粒细胞白血病首选药是白消安片，但它会引起血小板减少、肺纤维化、闭经等不良反应。DAG治疗白血病作用较白消安片快，且对白消安片有抗药性的患者换用此药也有一定的疗效[6-7]，临床应用总缓解率>80%[6-7]。鉴于其在治疗白血病方面突出的医疗价值，有学者研究了DAG对人脑肿瘤细胞IMR-32、人肺癌细胞H460、人肝癌细胞BEL-7404、人胃癌细胞SGC-7901、人鼻咽癌细胞CNE、卵巢癌细胞A2780的体外抑制作用，72 h后半数抑制浓度分别为24.28、15.98、16.73、16.00、4.12 和 15.15 μg/mL[8-10]。吴余燕等[11]研究了DADAG对人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞MGC、人鼻咽癌细胞HNE-1作用48 h后半数抑制浓度分别为 47.75、28.52、141.29和49.36 μg/mL。由此可见，DAG和DADAG在抑制脑肿瘤、肝癌、肺癌、鼻咽癌及卵巢癌等方面也有疗效。

3 DAG和DADAG抗肿瘤作用机制

肿瘤是一类细胞增殖、分化异常的疾病，药物治疗肿瘤的理论依据在于促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的生长繁殖及转移和促进肿瘤细胞的分化。肿瘤的增生过程中，也必然伴随一个毛细血管网为其提供足够的氧和营养物质，如果可以抑制毛细血管网的生长，也可以抑制肿瘤的生长[12]。

3.1 促进肿瘤细胞凋亡 细胞凋亡是由体内外因素诱导细胞内预存的死亡程序被激活而导致细胞死亡的过程，又称细胞程序性死亡。凋亡伴随的外在变化主要是细胞形态的改变，内在变化则涉及多条信号通路。已发现DAG和DADAG涉及到的凋亡通路有线粒体通路、P53通路和拓扑异构酶Ⅱ介导通路。

3.1.1 线粒体通路 当细胞发生应激反应后，细胞内凋亡信号会引起线粒体途径的凋亡。作为凋亡诱导因子的细胞色素C由线粒体外膜通过线粒体通透性转换（PT）孔释放到细胞质中，经过一系列途径激活半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）等因子，导致聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）断裂为具有生物活性的片段，具有DNA切割作用，最终导致细胞凋亡[13]。线粒体通路主要由B淋巴细胞瘤（Bcl）-2家族蛋白控制，根据结构和功能差异将其分为3类，一类为Bcl-2亚家族，具有抗凋亡作用，如Bcl-2、Bcl-xL等；一类为Bcl-2相关的X基因（Bax）家族，通常可以促进凋亡，如Bax等；一类为BH3-only亚家族，同样可以促进凋亡，如Bcl-xL/Bcl-2相关死亡促进因子（Bad）等。其中，促凋亡蛋白Bax等能使线粒体PT孔开放，促进线粒体凋亡途径的激活；而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl等则诱导PT孔关闭，抑制线粒体途径的细胞凋亡。BH3-only蛋白（如Bad）可以和激活后的Bax定位至线粒体中，通过抑制Bcl-2/xL蛋白，促进线粒体途径的细胞凋亡。苏桂玉等[14]将DAG作用于人小细胞肺癌细胞NCI-H1299，研究发现促凋亡蛋白Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，Caspase-3被激活。吴余燕等[15]研究了DADAG对肺癌NCI-H460细胞株的作用，发现Bcl-2表达减少，Bax表达增加，说明DADAG和DAG可以通过对Bcl-2和Bax蛋白进行调节，激活线粒体凋亡通路，实现其抗肿瘤作用。杨锦南等[16]通过对DADAG作用于人急性早幼粒白血病HL-60细胞株的实验发现，随着处理时间的延长和DADAG浓度的增高，Bcl-2、Bcl-xL基因下调的趋势也更显著，Bad蛋白水平明显上调，说明DADAG也可以作用于Bad蛋白，激活线粒体凋亡通路。

3.1.2 P53通路 P53是肿瘤抑制蛋白，对Bcl-2蛋白家族有重要调节作用。经研究表明P53蛋白可以直接激活Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax，从而促进Caspase级联反应，促进细胞凋亡。另外，P53还可作为转录因子促进凋亡蛋白的表达[17]。P53是沉默信息调节因子1（SIRT1）的底物之一，与SIRT1结合后，使其C端的赖氨酸残基脱乙酰基，导致P53失活[18]。周莹[19]在裸鼠体内研究了DAG对人NCIH460肺癌细胞诱导凋亡的机制，发现促细胞凋亡因子P53、Bax表达量增加，抑凋亡因子Bcl-2的表达减少。Xiao等[20]研究发现DAG以剂量依赖的方式降低了SIRT1、Bcl-2蛋白的表达，增加了P53、Caspase-3、Bax等蛋白的表达，说明DAG可以促进P53通路介导的细胞凋亡，抑制肿瘤的发展。

3.1.3 拓扑异构酶Ⅱ介导的通路 黄银妹[21]通过研究DAG对人肺癌细胞NCI-H460的作用，发现DAG能明显促进NCI-H460细胞的凋亡，作用机制研究表明DAG能降低Topo Ⅱ mRNA和蛋白水平，说明DAG可能有Topo Ⅱ抑制剂样作用，其可能作用于DNA、拓扑异构酶和Topo Ⅱ-DNA可切割复合物，来影响DNA的断裂和再连接反应，干扰DNA复制，导致细胞凋亡[22]。

3.2 抑制肿瘤细胞增殖 肿瘤是细胞增殖异常而形成的肿块，所以抑制肿瘤细胞增殖、阻滞肿瘤细胞周期可以控制肿瘤的发展。

3.2.1 抑制肿瘤细胞增殖 DAG对核酸合成前体物质有明显的抑制作用，从而阻碍了白血病细胞DNA和RNA的合成，使细胞的增殖也受到干扰[23]。

3.2.2 阻滞肿瘤细胞周期于G2/M期 细胞周期是由1组称为周期素（Cyclin）的蛋白和1组依赖于周期素的蛋白激酶（CDK）来调控的。引起G2期向M期转变的一个关键性物质是Cdc2/Cyclin Bl活性复合体[M期启动因子（MPF）]。Cdc2蛋白的磷酸化状态与其活性相关，其第14、15位的氨基酸去磷酸化会激活Cdc2，反之会抑制Cdc2激酶活性。细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（Cdc25C）可以水解Cdc2第14、15位的磷酸基团，从而激活Cdc2蛋白。而另一种细胞周期调节蛋白Wee1可将Cdc2第14、15位的磷酸基团磷酸化，使Cdc2蛋白失活[24]。当DNA双链断裂时，可以通过磷酸化Cdc25C，加速Cdc25C的泛素化降解，阻滞MPF激活[25]。Zhai等[26]发现DAG可导致DNA双链断裂，不可逆地阻滞细胞周期于G2/M期，促进肿瘤细胞凋亡。Zhang等[27]研究DADAG对人肝癌细胞QGY-7703的增殖抑制作用，检测到Cyclin B1在细胞内聚集，但Cdc2蛋白表达下降，M期启动因子活性受到抑制，导致G2/M期细胞周期阻滞。Peng等[28]研究DAG对人神经胶质瘤细胞株LN229、U251、U87MG的作用，发现DAG通过抑制Cdc25C蛋白的表达，在G2/M期诱导细胞周期阻滞，发挥其抗肿瘤作用。闫雪莲等[29]通过实验研究DADAG对人前列腺癌PC-3M细胞内鸟氨酸脱羧酶（ODC）活性的影响，结果显示DADAG可降低ODC的活性，同时检测到周期相关蛋白CyclinB1、Wee1等蛋白的表达增加，Cdc25C的表达降低，细胞周期阻滞于G2/M期。但是，ODC活性降低，抑制多胺的合成，而多胺对细胞周期也有调节作用，其与周期相关蛋白表达之间是否存在因果关系还有待探讨。

3.2.3 阻滞肿瘤细胞周期于G1/S期 P21蛋白是CDK的抑制剂，通过干扰细胞周期蛋白来调节细胞周期，抑制细胞从G1期到S期的转变[30-31]。DNA损伤后，通过一系列调节减轻P53的抑制或降解，导致P53的稳定和激活。活化的P53可通过刺激P21的表达参与细胞周期抑制。Zhai等[32]研究DAG对人神经胶质瘤细胞株的作用，发现DAG通过激活P53-P21信号级联，在G1/S期诱导细胞周期阻滞，发挥抗肿瘤作用。

3.3 抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭 肿瘤细胞侵袭与转移过程非常复杂，主要受细胞外基质（ECM）降解、细胞黏附分子等多个因素的影响。基质金属蛋白酶（MMP）和尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）等对ECM均具有广泛的降解作用，能促进细胞侵袭和转移。将DAG作用于胶质母细胞瘤和HepG2肿瘤细胞，发现DAG可以通过抑制MMP2、MMP-9和uPA因子的表达来抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，抑制肿瘤患者复发、病情恶化[20，33]。

3.4 抑制肿瘤血管的生成 血管内皮生长因子（VEGF）是一类能够调节血管生成的因子，包括VEGF-A等，VEGF受体是酪氨酸激酶受体家族，包括 了 VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3。 VEGF-A 和VEGFR2结合可以促进血管生长，是VEGF正调控的主要通路[34]。SP1能通过细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）磷酸化反应，诱导肺癌细胞VEGF的表达[35]。刘敬弢等[36]研究DADAG对小鼠H22移植瘤的作用，发现DADAG可以降低小鼠肿瘤质量和肿瘤组织中微血管密度（MVD），与血管生成的相关蛋白VEGF及SP1的表达量明显减少。Jiang等[33]研究发现DAG在体外和斑马鱼模型中均能抑制肿瘤血管生成，机制研究发现是通过抑制VEGF/VEGFR2和成纤维细胞生长因子（FGF）2/FGFR1信号通路抑制血管生成。

3.5 其他途径 自噬是肿瘤细胞对抗各种抗肿瘤作用的有效手段，通过降解受损肿瘤细胞的细胞器、大分子蛋白质，为肿瘤细胞提供生物合成所需的分子底物，帮助其应对恶劣的生存环境并维持细胞稳态。特别是在肿瘤化疗过程中，自噬能够通过隔离并降解被药物破坏的蛋白质或细胞器，保护肿瘤细胞，降低化疗药物的疗效[37-40]。Zhang等[41]采用DAG处理C6大鼠胶质瘤细胞，发现微管相关蛋白1轻链3（LC）3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，P62表达增加，说明DAG可以通过抑制细胞自噬途径控制肿瘤的发展。

4 联合用药

DAG（周期非特异性药）与美登新（周期特异性药）同时或间隔24 h给药对艾氏腹水瘤小鼠的生命延长有协同作用，不同先后顺序给药对白血病L1210细胞也有协同作用，应用DAG后24 h再予美登新，对B16黑色素瘤质量抑制有协同作用，联合用药对肝癌细胞HEPA及S180没有协同作用[42]。DAG和长春新碱（VCR）联合使用对小鼠淋巴细胞白血病L1210有协同疗效，对小鼠骨髓干细胞也有微弱的协同杀灭作用[43]。同时给药DAG和阿糖胞苷（AraC），或先予DAG，均有明显的协同疗效。DAG和甲氨蝶呤（MTX）先后给药对小鼠白血病L1210细胞也有协同作用，尤其是先予DAG，生命延长率达193.1%[44]。替莫唑胺与DAG联合用药，可以增强疗效[45]。使用DAG和射线结合对多形性成胶质细胞瘤患者治疗效果明显，且DAG能够增加肿瘤细胞对放疗的敏感性[46]。DADAG与抑癌基因P53联合作用于人肝癌细胞BEL-7404，有明显协同作用[47]。

5 小结与展望

目前，肿瘤发病率逐年上升，临床治疗尚无特效药物，已有的治疗方式如放化疗对人体损伤很大，寻找更有效、更安全的治疗药物迫在眉睫，而DAG和DADAG均具有较好的抗肿瘤活性，且DAG和DADAG是多靶点药物，涉及到多条信号通路调控，影响肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移及其周围毛细血管网的生成，进而发挥抗肿瘤作用，说明DAG与DADAG有较高的研究价值。虽然已有研究涉及白血病、肝癌、肺癌和脑肿瘤等多种肿瘤疾病，且疗效较好，但其抗肿瘤作用机制并没有完全阐明，临床应用较少，尤其是对DADAG的研究更少，可以展开更深入的机制研究和临床研究，挖掘其更大的临床价值。临床上对于肿瘤的治疗不仅局限于采用DAG、DADAG单独用药或联合用药，同时也可以结合基因治疗、放疗等方法，以期有更好的治疗效果，需要更深一步研究。