具有降胆固醇功能的罗伊氏乳杆菌的筛选 及其益生作用

余萍，矫艳平，张春宇，赵迪，宋佳，王婷婷，江枫

（汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司，辽宁沈阳 110000）

近年来，随着人们生活水平的不断提高，膳食结构的改变、缺乏运动及不良生活习惯的影响，血脂异常的人群明显增加[1]。血脂异常主要包括甘油三酯、低密度脂蛋白、胆固醇其中一种或多种水平升高。血清中过高的胆固醇是引起动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病重要因素之一[2,3]。人体血清胆固醇含量比正常水平每升高1 mmol，人体患冠心病的危险就会增加约35%[4]。因此降低血清胆固醇是人们预防心血管疾病的有效措施之一。然而，相关药物价格高且副作用大，利用天然食物或微生物来降低血清胆固醇成为人们研究的热潮[5]。

益生菌是一类能够定植于宿主肠道内，并能够产生对肠道有害微生物具有抑制作用的乳酸、细菌素及过氧化氢等物质而促进宿主肠道健康的活性微生物的总称，目前被广泛应用于食品和医药领域[6,7]。以乳酸菌为代表的益生菌是人体不可缺乏的有益菌，乳酸菌是一类能够发酵糖类产生乳酸的革兰氏染色阳性无芽孢的细菌，常见的主要有双歧杆菌属和乳杆菌属[8]。相关研究发现，益生乳酸菌不仅具有维持肠道微生态平衡的作用，有些菌株还具有抗氧化、降胆固醇、调节机体免疫等特殊保健功能[9-11]。获得具有降胆固醇功能的菌株并能够用于高胆固醇血症的微生物制剂、保健食品的开发，对降低血清胆固醇的治疗具有重要意义。

本研究从奶豆腐样品中分离出5株乳杆菌，从中筛选出一株具有降胆固醇能力强的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri），并对其耐酸、耐胆盐及耐胃肠液方面进行了研究，为进一步开发降胆固醇功能方面的产品应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 样品

筛菌样品采样于内蒙古呼伦贝尔满洲里通达牧场制作的奶豆腐，无菌操作取样寄送至本实验室，并于-20 ℃条件保存备用。

1.1.2 培养基

MRS培养基：蛋白胨10 g/L、牛肉粉3 g/L、酵母粉4 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、柠檬酸2 g/L、乙酸钠5 g/L、葡萄糖20 g/L、七水合硫酸镁0.58 g/L、四水合硫酸锰0.25 g/L、吐温-80 0.6 g/L、番茄汁10 mL/L、琼脂粉20 g/L，pH调至6.5；115 ℃，30 min灭菌。

改良MRS培养基：MRS培养基中添加碳酸钙10 g/L、中性红0.05 g（1%浓度5 mL），调pH至5.5；115 ℃，30 min灭菌。

高胆固醇培养基（MRS-CHOL）：MRS培养基中添加巯基乙酸钠2 g/L、牛胆盐（进口）3 g/L、胆固醇0.1 g/L，pH调至6.5；115 ℃，30 min灭菌。

1.1.3 主要试剂及仪器

主要试剂：胆固醇（C8667 Sigma）、牛胆盐（TLC Sigma），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；PBS缓冲溶液（20X），生工生物工程（上海）股份有限公司；无水乙醇（分析纯），天津市永大化学试剂有限公司；冰乙酸（分析纯AR）、邻苯二甲醛（化学纯CP）、浓硫酸（分析纯AR），中国医药集团有限公司；硫代乙醇酸钠（巯基乙酸钠）（分析纯AR），上海麦克林生化科技有限公司；氢氧化钾（分析纯），天津市瑞金特化学品有限公司；正己烷（分析纯AR），天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

主要仪器：SW-CJ-2D双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；DHP-500BS电热恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器厂；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；XSP-10CA生物显微镜，上海佑科仪器仪表有限公司；DZKW-S-8电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；SCIENTZ-DⅡ 超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技有限公司；Multiskan FC酶标仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；TGL-16M低温高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；LAI-3DT厌氧工作站，上海龙跃仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离纯化

取适量样品加入到灭菌的缓冲蛋白胨水培养基中，混匀后放入37 ℃培养箱中培养24～48 h；然后取500 μL培养液加入到4.5 mL改良MRS培养基中振荡混匀，用生理盐水进行从10-2～10-6稀释度依次十倍梯度稀释，每个稀释度分别吸取100 μL加入到改良MRS固体平板培养基上，用涂布棒进行涂布，每个稀释度做两个平板涂布，然后将平板倒置放入自封袋中，其中一个再装入厌氧袋中，均置于入37 ℃培养箱培养48 h。

挑取具有目的菌株典型特征（观察形态、大小、色泽、及其透明度等）、菌落较大、活性较强的单菌落，于改良MRS固体培养基上进行划线纯化培养，37 ℃培养24～48 h，如此反复2～3次，直到划线平皿中菌落特征一致；将纯化菌株进行革兰氏染色，显微镜观察及过氧化氢实验，将革兰氏染色阳性及过氧化氢酶阴性的菌株定为疑似乳酸菌，将纯化后菌株接种于MRS斜面培养基上培养，4 ℃保存备用。

1.2.2 降胆固醇功能性测定

1.2.2.1 胆固醇标准曲线的绘制

制备1 mg/mL胆固醇溶液：称取0.1 g胆固醇，用无水乙醇定容至100 mL，用0.22 μm有机滤膜过滤除菌后4 ℃储藏备用。

胆固醇标准溶液配制：分别吸取50、100、150、200、250、300 μL 1 mg/mL胆固醇溶液于10 mL干净的容量瓶中，用无水乙醇定容，配成5、10、15、20、25、30 μg/mL的标准溶液。

吸取胆固醇标准溶液4 mL于50 mL离心管中，用60 ℃下氮气吹干仪通氮气流吹干溶剂，加入4 mL邻苯二甲醛溶液，震荡，静置10 min后，加入2 mL浓硫酸，混匀，显色10 min，用不加胆固醇标准溶液的邻苯二甲醛和浓硫酸为空白调零，测定550 nm处的吸光值。以胆固醇浓度（μg/mL）为横坐标，ΔOD550为纵坐标，绘制胆固醇标准曲线（图1）。

图1 胆固醇标准曲线Fig.1 Cholesterol standard curve

1.2.2.2 试验菌株的制备

将1.2.1中分离纯化的菌株划线分离出单菌落，挑取单菌落接种于5 mL MRS液体培养基中，37 ℃条件下培养20 h后，再次转接至100 mL MRS液体培养基中，37 ℃培养17 h，4 ℃保存备用。

1.2.2.3 降胆固醇能力的测定

采用邻苯二甲醛比色法[12,13]来测定菌株的降胆固醇能力。取1.2.2.2培养后的菌液按10 g/L接种量接种于50 mL高胆固醇培养基中，37 ℃厌氧培养24 h，然后以8000 r/min的转速4 ℃离心10 min，收集上清液，通过邻苯二甲醛法测定上清液中胆固醇含量。以未接种菌株培养液的高胆固醇培养基做对照。按下面公式（1）计算降胆固醇率。重复实验3次求平均值。

式中：

C0——未接种培养液离心上清液中胆固醇实测浓度，μg/mL；

C——接种后发酵液离心上清液中胆固醇实测浓度，μg/mL。

1.2.3 降胆固醇功能菌株的鉴定

1.2.3.1 形态学特征鉴定

将菌株HCS02-001接种至MRS琼脂培养基37 ℃培养48 h，观察菌株形态。并挑取单个菌落进行革兰氏染色，在生物显微镜下观察菌体形态。

1.2.3.2 生理生化及16S rDNA鉴定

菌种生理生化特征鉴定及16S rDNA鉴定委托中国科学院微生物研究所完成。

1.2.4 耐酸性试验

将活化三次的菌液按照10%的接种量分别接种于空白对照、pH 2.0和pH 3.0的MRS培养基中。37 ℃静置培养，于17 h取样，用灭菌的生理盐水进行系列10倍稀释，分别取适宜稀释度的菌液1000 μL进行活菌计数操作，每个稀释度2次重复，37 ℃静置培养36～48 h后计数。耐酸试验菌株存活率计算方法按公式（2）计算。

式中：

N1——不同pH条件培养后取样计数测得的活菌数；

N0——空白对照试验测得的活菌数。

1.2.5 耐胆盐试验

将活化三次的菌液按照10%的接种量分别接种于不同胆盐浓度0.3%、0.5%的MRS液体培养基中，37 ℃静置培养，于17 h取样，用灭菌的生理盐水进行系列10倍稀释，分别取适宜稀释度的菌液1000 μL进行活菌计数操作，每个稀释度2次重复，37 ℃静置培养36～48 h后计数。耐胆盐试验菌株存活率计算方法见公式（3）。

式中：

N2——不同胆盐浓度条件培养后取样计数测得的活菌数；

N0——空白对照试验测得的活菌数。

1.2.6 模拟胃液试验

配制人工胃液：取稀盐酸16.4 mL，加蒸馏水800 mL；加入胃蛋白酶10 g（1%，m/V），摇匀后用蒸馏水稀释至1000 mL，调节pH值至2.0，0.22 μm有机滤膜过滤除菌。

将活化三次的菌液振荡摇匀，取10 mL菌悬液进行5 ℃条件下离心（5000 ×g，10 min，5 ℃），获得菌泥，用PBS缓冲液冲洗2次，获得的菌泥重悬于10 mL人工胃液中，37 ℃条件下消化3 h，分别于0 h，3 h取样测活菌数。模拟胃液试验菌株存活率计算方法见公式（4）。

式中：

N3——模拟胃液中作用3 h后取样计数测得的活菌数；

N’ ——0 h取样测得的活菌数。

1.2.7 模拟肠液试验

配制人工肠液：用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液将PBS缓冲液pH调节至8.0后灭菌，再加入1.0 g/L的胰蛋白酶使其溶解，0.22 μm有机滤膜过滤除菌。

将活化三次的菌液震荡摇匀，取10 mL菌悬液进行5 ℃条件下离心（5000×g，10 min，5 ℃），获得菌泥，用PBS缓冲液冲洗2次，获得的菌泥重悬于10 mL人工肠液中，37 ℃条件下培养，并于0 h、2 h、4 h取样测活菌数。模拟肠液试验菌株存活率计算方法见公式（5）。

式中：

N4——人工肠液中作用不同时间点取样计数测得的活菌数；

N”——0 h取样测得的活菌数。

1.2.8 数据处理

每个试验重复3次平行测定，数据采用SPSS 19.0软件和Excel软件进行数据分析，当p＜0.05时，差异被认为是有意义的，结果表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 菌株降胆固醇能力筛选结果

将从样品中分离纯化后的菌株分别按照降胆固醇功能测定方法测定后，筛选出5株具有降胆固醇能力的菌株，结果见表1。5株菌均为革兰氏染色阳性、球状或杆状，过氧化氢酶阴性，初步判断为乳酸菌。通过邻苯二甲醛比色法测定胆固醇含量，结果发现菌株HCS02-001的胆固醇降解率最高，达到50.6%，其余4株菌的胆固醇降解率在10%～30%之间。近些年关于降胆固醇的益生菌的研究中，发现多种不同水平的胆固醇降解能力的菌株，包括嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌等多个菌种[14-19]。如王今雨等人从传统发酵乳制品中分离出一株胆固醇降解率32.87%的植物乳杆菌[20]，唐雅茹等人从传统发酵食品中筛选出了一株胆固醇降解率55.71%的植物乳杆菌[21]，李尧等人从传统自然发酵食品中筛选分离出30株具有降胆固醇功能的乳酸菌菌株，降解率最高为37.15%[22]等，关于降胆固醇功能菌株的现有研究中，菌株HCS02-001的胆固醇降解能力处于较高水平，具有较高的开发价值，故选择菌株HCS02-001进行菌种鉴定及益生作用研究。

2.2 降胆固醇功能菌株的鉴定结果

2.2.1 菌株的形态学鉴定

图2 菌株HCS02-001的菌落形态Fig.2 Colony morphology of strain HCS02-001

图3 菌株HCS02-001的菌体形态（16×100）Fig.3 Morphology of strain HCS02-001

将菌株HCS02-001接种至MRS琼脂培养基37 ℃培养48 h后观察菌株形态，结果见图2。单菌落直径约1～3 mm，圆形，颜色呈白色，菌落表面光滑，水润，不凸起。挑取单个菌落进行革兰氏染色并在生物显微镜下观察菌体形态，结果如图3所示，革兰氏染色阳性，短杆状，长宽比大约为4:1，单个或成对出现。

表1 菌株筛选结果Table 1 Results of strain screening

2.2.2 生理生化及16S rDNA鉴定结果

菌株HCS02-001生理生化鉴定结果见表2。根据菌种的细胞形态、生理生化特征、16S rDNA基因序列等实验数据综合分析，参考《伯杰氏系统细菌学手册》[23]、以及International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology有关研究论文，并通过在美国生物工程信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）查阅国际相关的基因库，将本文的罗伊氏乳杆菌CGMCC No. 19746的16S rDNA序列与GenBank提交菌株序列相似性比较（见表3），鉴定菌种HCS02-001为罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）。16S rRNA基因序列测定结果见图4所示。

表2 菌株HCS02-001生理生化实验结果Table 2 Physiological and biochemical test results of strain HCS02-001

图4 16S rRNA基因序列测定结果Fig.4 Results of 16S rRNA gene sequencing

表3 菌株HCS02-001的16S rDNA序列同源性分析Table 3 16S rDNA sequence homology analysis of strain HCS02-001

2.3 耐酸性试验结果

益生菌经口服进入人体内须经过胃才到达肠道发挥益生作用，因此必须具有耐受强酸环境的能力。空腹时人体正常胃液pH为2.0以下，进食后pH能达到3.0左右[24-26]。因此本试验选定pH 3.5、pH 3.0、pH 2.5、pH 2.0、pH 1.5进行检验菌株HCS02-001的耐酸性能力。由表4可知，菌株HCS02-001生长状况良好，活菌数随着pH降低虽有所下降，但pH 2.0和pH 1.5时菌株存活率仍可达到85.52%和58.58%，该菌株具有很好的耐受酸环境的能力，能够耐受胃环境进入肠道。

表4 罗伊氏乳杆菌HCS02-001耐酸性试验结果Table 4 Acid resistance test results ofLactobacillus reuteri HCS02-001

2.4 耐胆盐试验结果

人体肠道胆盐浓度通常维持在0.03%～0.30%范围左右，益生菌的耐胆盐能力是保证其在肠道存活的先决条件[27,28]。本试验选用0.30%、0.50%、1.00%、1.50%的胆盐浓度考察菌株的耐胆盐能力，结果见表5。菌株HCS02-001在四个胆盐浓度条件下培养17 h菌株存活率均在90%以上，说明该菌株具有较强的耐胆盐能力，能够在肠道内存活发挥作用。

表5 罗伊氏乳杆菌HCS02-001耐胆盐试验结果Table 5 Bile salt resistance test ofLactobacillus reuteri HCS02-001

2.5 模拟胃液试验结果

益生菌进入人体内经过胃环境时，胃蛋白酶原能在胃液的酸性环境下被激活而杀死进入胃内的菌体，因此，益生菌不仅需要具有耐酸的能力，还需要能够耐受胃蛋白酶的作用才能存活[24]。本试验将菌株HCS02-001置于人工胃液中作用3 h，结果见表6，经过人工胃液作用后存活率达到96.74%，说明其具有较强的耐受胃液的能力，可以较高的活性通过胃环境进入肠道。

表6 罗伊氏乳杆菌HCS02-001模拟胃液试验结果Table 6 Results of simulated gastric juice test for Lactobacillus reuteri HCS02-001

2.6 模拟肠液试验结果

益生菌进入肠道后必须具有能够耐受肠液的能力才能保持较高的存活性发挥其益生作用，本试验中罗伊氏乳杆菌HCS02-001菌泥在人工肠液中37 ℃条件下培养4 h后，结果如表7所示，菌株存活率为98.41%，该菌株对肠液具有很强的耐受能力。

表7 罗伊氏乳杆菌HCS02-001模拟肠液试验结果Table 7 Results of simulated intestinal fluid test ofLactobacillus reuteri HCS02-001

3 结论

本试验从内蒙古呼伦贝尔满洲里通达牧场制作的奶豆腐样品中分离筛选出5株具有胆固醇降解能力的乳酸菌，其中菌株HCS02-001的降解能力最强，降解率达50.60%，其余4株菌的胆固醇降解率均在10%～30%之间。菌株HCS02-001降胆固醇能力在现有研究中处于较高水平，因此对菌株HCS02-001进行鉴定和益生功能的测定。通过对其进行形态学鉴定、生理生化鉴定和16S rDNA鉴定确定菌株HCS02-001为罗伊氏乳杆菌。在酸耐受试验及模拟胃液试验结果中可以看出，菌株HCS02-001的耐胃酸环境能力较强，能够以较高的存活性通过胃环境进入肠道。胆盐耐受及模拟肠液试验表明，菌株HCS02-001具有很强的耐受胆盐及肠液的能力，能够在肠道中以较高的活性发挥作用。罗伊氏乳杆菌HCS02-001胆固醇降解能力较强，且具有良好的耐逆环境能力，具有较高的进一步开发应用价值。