软骨细胞周基质及其参与力学信号转导的研究进展

杨峥，何乐人

(中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院耳再造一中心，北京 100144)

1925年细胞周基质(pericellular matrix，PCM)在软骨组织中被首次发现[1]，PCM从细胞膜表面向外延伸数微米并环形包绕细胞的基质条带[2]，广泛存在于红细胞、内皮细胞、上皮细胞、软骨细胞、平滑肌细胞等[3]。PCM的主要成分是富电荷的蛋白多糖，蛋白多糖易于水化、含水量高[4]，在常规组织切片制备过程中蛋白多糖易被破坏，因此在传统相差显微镜和微分干涉显微镜下难以观察PCM[5]，限制了PCM相关研究。随着红细胞固定对比显像、纳米视频增强显微技术、示踪速度测量学等观察和研究方法的改进[3]，人们对于PCM组成、结构和功能的研究逐渐深入，其在细胞内外信号转导和细胞表面生化活动中发挥的重要作用得到揭示。近年来关于PCM的研究主要集中于肿瘤侵袭转移[6]、骨与软骨损伤的修复和再生[4]、心血管疾病[7]等方面，其在细胞运动[8]、细胞分化[6,9]、微环境维持[10]、力学传导[11]等活动中发挥作用。PCM有助于维持软骨结构和力学特性，作用涉及软骨的发育、退化、修复、再生等，提示PCM在软骨相关疾病中有重要作用[12-14]，可应用于软骨组织工程[15-16]。现就软骨PCM组成结构和生物力学相关的研究进展，以及PCM成分、作用及参与力学信号转导的机制进行综述。

1 PCM的主要成分

软骨组织中，PCM与其所包裹的软骨细胞共同构成软骨单位[17]。随着机械法和酶消化法的改进，软骨单位的分离日益便捷，这为研究PCM奠定了基础[18]。作为软骨细胞与细胞外基质的连接成分，PCM位于软骨细胞与细胞外基质之间，厚度为1～5 μm，在软骨组织的不同区域，包裹数目不同的同源软骨细胞群[3,19]。

PCM的主要成分是Ⅵ型胶原和蛋白聚糖[20]。与细胞外基质相比，PCM含有特异性的Ⅵ型胶原[20]，含量更高的基底膜蛋白多糖[21]、蛋白多糖单体或低聚物[22]、透明质酸[23]、二聚糖[24]、Ⅸ型胶原[25]等。组成的差异影响了基质的特性，随着软骨细胞空间排列的变化，PCM和细胞外基质的弹性变化并不同步[14]。

1.1Ⅵ型胶原 Ⅵ型胶原是PCM的特异性成分，分布于软骨组织，常作为软骨单位和PCM的特有标志物。与其他类型胶原相比，Ⅵ型胶原在结构和功能不同，进而影响着PCM的构成和功能。结构上，Ⅵ型胶原在细胞内组装为四聚体，无乙醛介导的交联[26]，通过整合素α3β1和跨膜蛋白多糖神经胶质抗原2锚定在软骨细胞膜上，形成独立的网状结构[27]。功能上，Ⅵ型胶原的存在影响PCM的发育和软骨组织的生物力学性质，促进软骨细胞的增殖和组织再生，对软骨细胞具有炎症保护作用[28]。在Ⅵ型胶原基因敲除的小鼠中，关节软骨中PCM形成受阻、刚度降低，骨关节炎进程加快[29]。Smeriglio等[30]的研究发现，培养基中添加Ⅵ型胶原能够促进软骨细胞增殖，但将Ⅵ型胶原铺于培养皿底则无此作用；可溶性Ⅵ型胶原的促增殖作用在骨髓来源的间充质干细胞中亦得到证实[31]，提示Ⅵ型胶原以某种结构形式参与细胞增殖的受体-配体反应。在软骨组织的不同区域，PCM的形态不同，而在PCM区域，Ⅵ型胶原的分布亦不均一，这种差异性分布与PCM不同区域弹性模量的递变直接相关[1]。Ⅵ型胶原作为PCM的主要成分，在同一软骨单位、不同软骨单位间的含量差异是构成PCM空间分布差异的基础。

1.2基底膜蛋白多糖 基底膜蛋白多糖是一种大分子硫酸乙酰肝素蛋白多糖，通过HS链与Ⅵ型胶原结合，与Ⅵ型胶原共定位于PCM区域[32]。与Ⅵ型胶原分布相同，基底膜蛋白多糖分布呈梯度变化，主要聚集在PCM靠近软骨细胞的区域[33]。

基底膜蛋白多糖可与纤维连接蛋白和层粘连蛋白相互作用，通过HS链传递电子[34]，与硫酸乙酰肝素一起作为成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2，FGF-2)的胞外基质储备库，通过释放FGF-2起到力学传导作用[35]，基底膜蛋白多糖及其参与的力-化学信号转导是PCM力学性质的基础。Wilusz等[33]利用结合免疫荧光标记的原子力显微镜检测发现，PCM中靠近软骨细胞的内部区域的弹性模量较外周区域低，这一趋势与基底膜蛋白多糖在PCM内部区域和外周区域的分布差异一致，提示基底膜蛋白多糖参与降低软骨细胞周围的弹性模量。Xu等[36]利用原子力显微镜检测小鼠软骨细胞和周围基质硬度发现，敲除基底膜蛋白多糖的小鼠软骨细胞和PCM硬度显著降低，提示基底膜蛋白多糖在维持软骨力学性质上不可或缺。基底膜蛋白多糖在PCM不同区域表现出分布差异，进而影响PCM的机械性质，这是PCM传导力学信号的基础。

1.3其他成分 近年来利用蛋白组学[37-38]、免疫荧光定位、双向电泳和质谱分析等技术在PCM中发现了更多成分，包括血管性血友病因子A结构域相关蛋白、三磷酸异构酶、转化生长因子-β-诱导蛋白、转化生长因子-β-结合蛋白-2[18]、Ⅺ型胶原[39]等。免疫荧光定位检测发现以上成分位于PCM区域，与Ⅵ型胶原和基底膜蛋白多糖共同构成PCM，维持软骨微环境的稳态。

PCM结构和成分的稳定保证了软骨组织微环境稳态，感知和响应生物力学微环境的扰动，维持基质稳态和细胞间交流[3]。Wilusz和Guilak[40]的研究发现，PCM对于酶的消化有高度抵抗作用，弹性蛋白酶消化部分蛋白聚糖、胶原蛋白后，PCM弹性模量降低24%，而PCM的微机械性能不受软骨素酶、聚蛋白多糖酶、透明质酸酶消化的影响。de Vries等[41]发现，体外培养的软骨细胞随着基质的沉积和增厚，PCM的杨氏模量逐渐增高，相同机械加载条件下细胞变形显著降低，表明PCM的稳定对软骨细胞变形有保护作用。另一方面，PCM的组成和结构不是一成不变的。PCM参与软骨细胞-基质间信号转导，通过修饰生长因子或其他信号分子作用于软骨细胞，影响对代谢和刺激信号的反应[42]。此外，PCM的超分子结构也会随细胞和环境的变化而改变[34]，在细胞分裂和细胞黏附中，蛋白聚糖和透明质酸的分布、类型及空间组织结构随胞膜形态和细胞形变而改变[43-44]。

体外培养的软骨细胞中，PCM的组装积累和重构是软骨细胞行为的重要部分，PCM的成分及其分布能够反映软骨细胞的活力、增殖和代谢等过程，有望成为评价软骨细胞的新指标，对软骨细胞检测和新生软骨评价有积极意义，在软骨细胞治疗和软骨组织工程中有着较为广阔的应用前景。

2 PCM在力学信号转导中的作用

PCM具有机械传感特性，能够调节细胞外基质传输的力学信号[3]，完成力学-生化信号转导。功能上，PCM独特的结构和功能显著影响软骨细胞的微机械环境，PCM作为生物信号和力学信号的过滤器和传感器，在组成软骨细胞-基质力学信号转导中发挥重要作用[18]。

2.1结构基础 PCM中的Ⅵ型胶原和蛋白聚糖构成多孔多渗的空间网状结构，水分子、离子填充其中。当软骨组织受到机械压力时，PCM中的间隙水渗出，引发蛋白聚糖表观浓度增加，间隙离子聚集，固定电荷密度和离子浓度瞬时变化，继而引发局部渗透性改变，完成力学-生化信号的转导[45]。Hing等[46]研究发现，利用酶溶法和机械分离两种方法获取独立的软骨单位，当周围渗透压改变时，软骨单位中软骨细胞表现出的肿胀反应与不含PCM的软骨细胞不同，提示周围环境中的机械化学刺激作用于PCM，通过PCM的调制引起软骨细胞应答，进而影响软骨组织的生理病理过程。Khoshgoftar等[47]通过构建关节软骨无限加压的固体-溶质-离子三相有限元模型发现，在关节软骨中存在深度依赖的应变场，软骨细胞剪切应力对PCM和局部细胞外基质的机械性能敏感；在软骨机械环境变化早期，即使没有宏观组织性能的结构变化，PCM和局部细胞外基质的微观结构改变也会导致软骨细胞剪切应变增加。与正常软骨相比，骨关节炎的软骨组织中PCM刚度降低，其标志成分Ⅵ型胶原和基底膜蛋白多糖出现降解，PCM的变化与软骨细胞空间结构变化保持一致[13]。超微结构水平下，PCM中胶原纤维调节软骨细胞机械微环境的作用也得到证实，Korhonen和Herzog[48]证实，软骨细胞体积对胶原纤维的刚度变化高度敏感，其排列趋势与软骨细胞的空间位置有关，提示PCM在软骨发育和退变中调节机械微环境的重要作用。

PCM的结构基础是维持软骨微环境、发挥生物效应的前提，PCM与细胞膜和基质成分相关，Ⅵ型胶原和基底膜-蛋白多糖通过对应受体锚定于细胞膜表面，同时能够与PCM中的多糖相连，相互沟通，PCM的完整和稳定对发挥力学作用有重要影响。Xu等[36]在敲除基底膜蛋白多糖基因的Schwartz-Jampel综合征小鼠模型中通过原子力显微镜观察发现，胚胎肱骨中软骨细胞和软骨组织的刚度下降，提示在软骨发育过程中，基底膜蛋白多糖在PCM内外机械信号转导和细胞内应答中发挥作用，对于正常软骨力学的维持必不可少。Alexopoulos等[29]在敲除Ⅵ型胶原的小鼠模型中也观察到类似现象。与之相对应的是，从软骨组织中分离出的独立的软骨细胞(不含PCM)在体外三维培养条件下，随着PCM组装和基质沉积，细胞-PCM整体刚度和表面模量逐渐增加[16,49]。

2.2信号转导 细胞常见的机械刺激受体有细胞表面的整合素、钙离子通道、原发性纤毛和非选择性细胞表面通道[50]等。Ⅵ型胶原、基底膜蛋白多糖等结合于软骨细胞表面，通过跨细胞膜表面受体(如整合素和盘状区域受体)将机械刺激信号传至软骨细胞，引发胞内改变[51]。Zelenski等[52]通过原位测量细胞学行为和基质特性发现，Ⅵ型胶原通过瞬时受体电位香草酸亚型4介导的Ca2+信号参与调节细胞外基质-PCM-软骨细胞的机械应力及渗透应力的传导和传递，其中Ⅵ型胶原未直接参与物理和化学信号转导，而是通过瞬时受体电位香草酸亚型4发挥作用。

PCM的网状结构中储存着多种类型的生长因子和其他调控分子，作为生长和调控因子库，在组织受到机械刺激时释放出生长或调控因子参与生物力学信号转导。其中具有代表性的是转化生长因子-β[53]和FGF-2[54]。软骨组织在受到切割和循环加压刺激时，隔离在基底膜蛋白多糖硫酸乙酰肝素链上的FGF-2释放，作用于软骨细胞[55]。FGF-2通过与软骨细胞表面不同的FGF受体结合，发挥不同的作用，FGF-2促进软骨分解和抑制软骨合成的作用主要通过FGF受体1介导，而保护软骨的作用则通过FGF受体3介导[56-57]。在维持软骨微环境的动态平衡中，不同受体表达和受体阻滞参与信号传递过程，产生信号传递和生物反应多样。此外，Sun等[35]在研究中发现，包括FGF-2在内的成纤维细胞生长因子家族在PCM中的结合和扩散受限于PCM中胶原蛋白和蛋白多糖相互作用，PCM复杂的空间结构保证了黏附和受体结合位点空间分布的独立性。

PCM中相互作用的高度多样性为连接细胞-基质和细胞-细胞的动态网络奠定了基础，对局部微环境的扰动保持敏感。在机械载荷作用下，PCM通过分离和释放不同的分子、离子调整PCM结构，将力学信号传至软骨细胞。目前，对生物力学信号转导过程中各类信号分子、释放机制、传导通路和调节机制的研究，能够部分解释PCM和软骨细胞的生物学行为、软骨疾病的病理生理过程[58]，但仍有许多未知和争议之处，需继续深入研究。随着PCM在瞬时受体电位香草酸亚型4相关通路、FGF受体介导的力学传导过程中的作用逐步揭示，寻找前者的靶向位点以干预软骨组织的力学性质，进而应用于软骨相关疾病的治疗以及构建新生软骨领域等逐渐成为可能。

3 结 语

PCM独特的成分和结构使其在维持软骨细胞微环境、力学性质和细胞-基质间力学信号转导中发挥重要作用，维持机械微环境的同时，在生化-力学信号的放大、反馈、调节等方面起着重要作用。

PCM维持软骨局部微环境稳态，对生化-力学信号反应敏感，在软骨相关疾病早期其已出现成分和力学性质的显著改变，研究PCM有助于早期诊断软骨相关疾病。PCM的高亲和网状结构和生理条件下基质组装、胶原沉积和组织重构、仿生学的组织构建为软骨组织工程提供了新思路。调整外源刺激、调节信号分子、选择性激活信号通路，通过干预软骨生物-力学信号转导过程获得可控的生物力学性质，在软骨疾病的治疗和软骨组织工程等领域具有广阔的应用前景。