代谢组学在急性冠状动脉综合征早期诊断和危险分层中的应用

李菲，袁健瑛，李东泽，廖晓阳，曹钰，万智

(1.四川大学华西医院 a.急诊科 急诊医学研究室 国家老年疾病临床研究医学中心，b.全科医学中心，成都 610041；2.四川大学 a.灾难医学中心，b.卒中中心，c.护理学院急救与创伤护理学教研室，成都 610041)

近年来，世界范围内的心血管疾病发病率逐年升高，已成为最常见的死亡原因。《中国心血管病报告2018》指出，心血管疾病所致死亡是我国居民死亡的首要原因，预计我国现有心血管疾病患者2.9亿，其中冠心病1 100万[1]。急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)是冠心病的常见类型，每年发病人数超过100万，其发病率随年龄增大而升高，可导致严重的疾病负担[2]。ACS常表现为总胆固醇和三酰甘油水平升高、高密度脂蛋白水平降低。ACS发病与动脉粥样硬化斑块的形成和破裂有关，在动脉粥样硬化斑块的形成过程中，大多数患者无临床症状，常出现隐匿组织损伤。因此，早期诊断ACS十分必要，可以有效预防动脉粥样硬化斑块的形成和破裂，改善患者预后。

ACS的常见危险因素包括糖尿病、吸烟、高血压、高脂血症等，根据上述危险因素评估ACS是常见策略，但缺乏特异性，且确切病理生理机制仍不清楚[3]。目前，ACS的临床诊断主要依靠临床症状、心电图、心肌标志物和冠状动脉造影，其中冠状动脉造影是诊断ACS的金标准，然而冠状动脉造影为有创检查，对技术要求较高，检查费用昂贵，且大量接受检查的患者血管正常[4-5]。在动脉粥样硬化斑块形成和破裂前，其表达的特异性小分子生物标志物具有巨大的疾病诊断价值，可以实现疾病的早期诊断和危险分层。代谢组学是生物系统中迅速发展的研究领域，可以识别及量化细胞、器官或生物体内分子量<1 500的小分子代谢物，有助于识别有诊疗价值的生物标志物，指导临床决策干预[6]。现对ACS发病涉及的病理生理机制进行初步回顾，并对代谢组学在ACS早期诊断和危险分层中的应用予以综述。

1 ACS的病理生理及分子机制

1.1ACS与动脉粥样硬化斑块 动脉粥样硬化形成的实验模型为斑块形成的分子机制提供了大量信息。由于缺乏反映人类疾病的动物模型，从稳定的动脉粥样硬化斑块到不稳定的动脉粥样硬化斑块的病理生理变化过程仍不十分清楚。临床上，动脉粥样硬化斑块的形成和进展可隐匿数年、数十年甚至终生，而动脉粥样硬化斑块破裂往往无症状，可逐渐演变成突然的急性冠状动脉事件，表明导致动脉粥样硬化斑块发展和不稳定的机制可能不同，事实上，动脉粥样硬化斑块的形成一般无症状，并逐渐发展为突然的冠状动脉阻塞。

ACS是最常见的心血管疾病，通常由动脉粥样硬化斑块破裂或侵蚀而加速形成。有学者认为，动脉粥样硬化斑块形成通常是动脉壁胆固醇、巨噬细胞和纤维蛋白组织多年积累的结果[7]。因此，一般在进入疾病晚期时，患者的症状才会出现。动脉粥样硬化斑块的形成与高胆固醇血症、高血压、糖尿病、吸烟以及心理因素等危险因素导致的血管内皮功能受损有关[8-9]。心肌坏死标志物，特别是肌钙蛋白I和T在ACS的诊断、危险分层和治疗中起着重要作用[3,10]。然而，高敏肌钙蛋白在ACS发病3～4 h升高，早期评估价值有限，高敏肌钙蛋白连续检测低于5 ng/L时，可排除ACS，其阴性预测价值较高，但阳性预测价值较低[11]。因此，有必要寻找新的特异性生物标志物对ACS进行早期诊断和风险评估，以指导临床决策。

1.2ACS的分子机制 ACS的发病机制目前尚不完全清楚，可能与糖尿病、高血压、高脂血症和吸烟等危险因素损伤血管内皮，导致内皮功能异常有关。血管内皮受损的特征是血管内皮一氧化氮生物利用度降低和内皮素-1产生增加，导致血管止血功能异常，黏附分子表达增加。此外，还可以增加血小板的产生，并通过分泌局部活性底物激活血液中的血小板，进而促进微血栓形成[12]。

动脉粥样硬化斑块的进展与内皮细胞内低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)向动脉壁的运输有关[12]。内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞等通过活性氧类将LDL转化为氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)，而ox-LDL可损伤内皮细胞，诱导P-选择素等黏附分子和单核细胞趋化蛋白-1、巨噬细胞集落刺激因子等趋化因子的表达，导致单核细胞和T淋巴细胞活化并进入内膜[13]。单核细胞和T淋巴细胞进入内膜，随后单核细胞消化脂蛋白并分化为巨噬细胞。树突状细胞是一种抗原呈递细胞，能够激活辅助性T细胞产生γ干扰素，从而激活巨噬细胞。巨噬细胞产生的活性氧类将ox-LDL转化为高氧化低密度脂蛋白，并被巨噬细胞吸收转化为泡沫细胞，随后泡沫细胞与白细胞结合形成脂肪条纹。随着单核细胞和巨噬细胞的增多，血管平滑肌细胞的增殖或迁移会产生脂肪条纹，导致更严重的血管损伤，最终表现为突向动脉腔内[14]。随后脂肪条纹发生钙化，并随着纤维化的进展形成围绕富含脂质核心的纤维帽，一般认为，纤维帽厚度<55 μm是导致致命斑块破裂的形态学指标[15]。在ACS纤维斑块破裂时，动脉粥样硬化斑块内物质的形成和释放会导致血栓，并最终导致血管阻塞[16]。

1.3炎症、胶原合成、斑块破裂和血栓形成 巨噬细胞能够产生3种消化细胞外基质的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)(MMP-1、MMP-8和MMP-13)，导致斑块破裂。人巨噬细胞对MMP的调节表明，T细胞来源的CD40配体增加了人巨噬细胞间质胶原酶的产生[17]。因此，获得性免疫T细胞和巨噬细胞之间的相互作用阻止了间质胶原的合成和降解。平滑肌细胞和巨噬细胞的比例在动脉粥样硬化斑块易损性和破裂倾向中起着重要作用，但大多数动脉粥样硬化斑块的破裂是可变、不可预测的[18]。研究表明，ACS引起全身炎症反应，导致斑块部位蛋白酶活性增加，进而加重炎症反应[19]。

动脉粥样硬化斑块纤维帽在ACS中起重要作用，现已成为研究的焦点。动脉粥样硬化斑块纤维帽变薄与致命斑块破裂相关，动脉粥样硬化斑块的胶原蛋白代谢缺陷在细胞外基质蛋白排泄以及纤维帽形成及促进中起重要作用[20]，表明胶原代谢介质可能参与了动脉粥样硬化斑块的形成过程，且动脉粥样硬化斑块内胶原的断裂可能损害了斑块的完整性，最终导致ACS的发生。

2 代谢组学简介及其在ACS中的应用

2.1代谢组学简介 代谢组学是生物化学领域的新兴学科，涉及基因组学、转录组学和蛋白组学，能够对细胞、器官及有机体内的小分子代谢物进行识别、量化和表征，可用于辅助疾病的诊疗，因此代谢组学被广泛应用于药理学、临床试验、毒理学、新生儿筛查和临床化学等领域[21]。心脏的代谢变化是生物体液中各代谢产物动态变化的过程，基于代谢组学技术可以用于分析ACS中生物标志物的表达水平[22-23]。与传统实验室检查技术相比，代谢组学可同时检测大量的代谢物，并能够广泛覆盖生物过程和代谢途径[24]。由于代谢组学与生物体基因型密切相关，故可以较为清晰地观察基因型-表型和基因型-环境之间的相互作用关系。

代谢组分析策略通常借助质子核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)和质谱(mass spectrum,MS)结合分离技术(如高效液相色谱、气相色谱或毛细管电泳)实现[25-26]。NMR是分析尿液和血浆样本的常用技术之一[27]，其原理为利用代谢混合物质量的不同，通过磁共振位移将样品中的单个分析物分离，从而产生光谱图谱。NMR可以提供复杂混合物中代谢物的结构信息和定量测定，且通常不需要化学加工制备样品，可重复性高。与MS相比，NMR相对不敏感，只可以检测毫米级和微米级的代谢物。

气相色谱-质谱(gas chromatography-MS，GC-MS)和液相色谱-质谱(liquid chromatography-MS，LC-MS)是目前鉴定小分子代谢物最常用的技术，MS测量分子形成离子的质量与电荷之比，通常用色谱技术将其分离，可测量任何可溶解的化合物。MS的灵敏度较核磁共振更高，因此越来越多地用于生物样品代谢物的测定[28]。GC-MS主要用于挥发性非极性代谢物的分析，样品在检测时蒸发到气相中，并通过GC色谱柱进行传输，要求分析物在高温下保持稳定，适用GC-MS的代谢物包括糖、糖醇、脂肪酸、有机酸、甾体和二甘油酯等。对于不挥发且不能衍生的代谢物，使用可选择性分离的液相色谱技术。LC-MS可以分析多种化学物质(极性和非极性代谢物)，具有很高的选择性和灵敏度。与LC-MS类似，毛细管电泳可以与质谱仪耦合，具有提高分离分辨率的独特优势[29]。

通常确定代谢谱的方法有靶向和非靶向。靶向分析通常以“模块化”形式进行，针对感兴趣的分析物簇的化学性质进行定向检测，结果更为精确，检测到的分析物通常只有数百种。非靶向代谢图谱能同时测量生物样品中大量的潜在代谢物或分析物，提供更真实的代谢组覆盖范围，但干扰更大，且耗时费财。因此，可以通过非靶向分析来产生新的假说，或在前期或其他研究的基础上确定新的代谢途径或候选生物标志物，进行针对性的检测，提高实验效率。

2.2代谢组学在ACS中的应用 心脏能量代谢在调节心脏功能中起着重要作用，在ACS的发生发展中，诸多代谢产物的产生、调节、失衡可以提供重要的疾病信息[21,30]，尤其在无症状的ACS发病早期，因此借助代谢组学的技术有助于实现ACS的早期诊断和危险分层，便于早期干预，改善ACS患者的预后。潜在的候选生物标志物可能对无症状ACS患者的早期诊断和危险分层有帮助，故需要加速发现新的疾病特异性生物标志物、药动学以及与疾病危险因素相关的代谢谱。

有学者采用NMR技术研究了心房颤动患者的代谢变化，以定量分析选定24种代谢物，结果显示心房颤动患者与正常体检健康人群的β-羟丁酸、酮体和甘氨酸水平比较差异有统计学意义，表明代谢谱中的酮体能够识别超过80%的心房颤动风险患者[31]。有研究对35例非ST段抬高型ACS患者和35名健康受试者进行GC-MS和LC-MS/MS分析确定了非ST段抬高型ACS患者和健康受试者中的68种代谢物，包括丙氨酸、2-羟基丁酸和2-酮-3-甲基戊酸等[32]。使用LC-MS技术分析1 010例心脏病患者血浆的研究显示，精氨酸及其下游代谢物与主要不良心血管事件发生存在密切联系[33]。有学者对9例非ST段抬高型ACS患者进行代谢研究，并将其与10例稳定动脉粥样硬化患者和10名健康受试者进行比较发现，与健康受试者相比，非ST段抬高型ACS患者的代谢物(如柠檬酸、4-羟脯氨酸、天冬氨酸和果糖)水平降低，而乳酸、尿素、葡萄糖和缬氨酸的水平增加[34]。

分析27例不稳定型心绞痛(unstable angina pectoris，UAP)和15例健康受试者的代谢图谱研究鉴定了共91种代谢物，最终筛选出5种能够识别UAP的代谢物，预测精准度为80%，包括D-呋喃糖、1-脱氧葡萄糖、棕榈酸、硬脂酸和4(1H)-吡啶酮[35]。Zhao等[36]在动物模型以及UAP患者血浆中鉴定出21种代谢物，这些代谢物的表达水平与对照者差异有统计学意义，其中8种代谢物在心肌梗死猪标本和UAP患者中共存，包括4,1-苯二羧酸、5,1-n-羟基胶质细胞醇、2-酮-去葡萄糖酸、壬二酸、庚酸、戊酸、核糖醇和丝氨酸。因此，这些代谢物可能是猪与UAP患者心肌梗死分子机制中的共同物质，但需要更多研究的证实。

Li等[37]分析比较27例UAP患者以及20名健康受试者的尿样，确定了20种可用于区分UAP的代谢物，包括肌酐、顺式-乌头酸、瓜氨酸等，表明通过代谢物的组合能够预测UAP，灵敏度为92.6%，特异度为90%，准确度为89.1%。另有研究显示，UAP患者体内的乳酸、肌醇、脂质、3-羟丁酸等水平上调，而苏氨酸、肌酸、胆固醇和谷氨酸等水平降低，故推测UAP患者的磷脂和氨基酸代谢可能受损[38]。肌酐来自肌酸和磷酸肌酸，磷酸原系统对细胞能量转移和身体稳态非常重要，正常情况下，大多数肌酸分子被转化成磷酸肌酸，最终通过可逆酶促反应产生ATP[39]。UAP患者的尿肌酐水平降低，表明这些患者不能产生ATP，因此需要更多的肌酸来产生ATP[40]，这可能是UAP患者体内各代谢产物产生动态变化的原因。

3小 结

生物体液的代谢组学是表征心血管疾病相关代谢紊乱的有效方法，小分子代谢物的表达差异可能反映潜在的ACS疾病进展，并作为生物标志物确定病理生理机制和治疗靶点。代谢组学有助于筛选ACS的早期诊断和危险分层的特异性生物标志物，但仍需要进一步对动脉粥样硬化斑块的发展和不稳定性进行研究，以确定其结果的准确性和敏感性。未来的前瞻性研究有助于实现整合组学数据向临床实践的转化，从而更好地服务于临床ACS的诊断和管理，提高疾病的诊治水平。