原发性胆汁性胆管炎小鼠模型及其应用研究进展

王资隆，靳睿，封波

(北京大学人民医院 北京大学肝病研究所 丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京100044)

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis，PBC)是一种由自身免疫介导、肝内胆管上皮细胞破坏导致的慢性胆汁淤积性肝病，以中年女性多见，临床症状主要为疲乏无力和瘙痒;病理表现为肝汇管区淋巴细胞浸润，选择性侵犯胆小管上皮细胞，造成肝内胆汁淤积，最终发展为肝衰竭;血清与免疫学指标为出现特征性的自身抗体［主要为抗线粒体抗体(antimitochondrial antibody，AMA)］、免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M与碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)水平升高［1］。其发病可能与遗传、环境、免疫、药物等因素有关，但具体病因与发病机制尚不明确。目前临床治疗中，尚有部分患者对熊去氧胆酸应答不佳，因此制备动物模型分析PBC病因、研究发病机制以及药物筛选、预后具有重要价值。在动物模型中，仓鼠的胆汁酸合成和代谢与人类最为相似，但研究者普遍以小鼠为主要模型，是因其具有体积小、孕期短和寿命长可满足实验周期需要等优点，此外还培育了背景明确的不同品系转基因小鼠，这对进一步探索疾病机制也有重要意义［2］。当前已构建多种具有人类PBC患者特征的小鼠模型，现就化学、生物诱导和基因修饰类PBC小鼠模型及其应用进展予以综述。

1 化学诱导类小鼠模型

1.1 2－辛炔酸诱导模型 2－辛炔酸是人工合成的物质，化妆品和口香糖中均有存在，具有被AMA阳性的PBC血清所识别的异源修饰表位。Wakabayashi等［3］将2－辛炔酸与牛血清白蛋白耦合免疫C57BL/6小鼠发现，其表现出类似PBC患者的特征。2－辛炔酸诱导小鼠可产生AMA，血清中的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)－α和γ干扰素(interferon，IFN)水平显著升高;病理可观察到汇管区大量以CD8+T为主的淋巴细胞浸润，以及胆管缺失、上皮肉芽肿等。

2－辛炔酸诱导小鼠模型构建简单，因此在机制研究及药物研发等方面应用广泛。研究者利用该小鼠模型对肝脏纤维化进行了不同探索，如Hsueh等［4］发现，外源性白细胞介素(interleukin，IL)－10可增加肝脏炎症与纤维化，这可能与其招募和激活CD4+T、CD8+T、自然杀伤和自然杀伤T细胞并增加胆管损伤有关;Hintermann等［5］发现，紧密连接黏附分子B和C在小鼠肝血管系统中上调，提示肝脏纤维化与其有关。也有研究者将人脐带源性间充质干细胞与2－辛炔酸－牛血清蛋白共同注射，结果显示其减弱了PBC的诱导过程［6］，这为临床治疗提供了新思路。

2－辛炔酸诱导小鼠在免疫学、血清学和病理上与人类疾病非常相似，尤其是淋巴细胞浸润类型。此外，还出现了特征性的单核细胞浸润与上皮肉芽肿。但该小鼠模型没有性别差异，且在肝脏病理中未观察到任何脂肪变性、嗜酸粒细胞增多症或胆汁淤积症的证据，也未观察到肝脏纤维化。

1.2 聚肌胞苷酸诱导模型 研究发现使用Ⅰ型IFN治疗的过程中，PBC症状会加重［7］。而聚肌胞苷酸可以诱导产生Ⅰ型IFN，并影响自身免疫。因此研究者尝试向小鼠注射聚肌胞苷酸，结果显示其表现出类似PBC的特征［8］。在24周时，大部分小鼠可检测到AMA，血清中细胞因子IL－12p70、IL－10、单核细胞趋化蛋白、IFN－γ和IL－6、丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平升高;肝组织病理可观察到淋巴细胞浸润，CD8+T细胞主要集中在胆管附近。此外，该模型还出现了肝外器官的自身免疫病变，如腮腺炎、胰腺炎和间质性肾炎［8］。

聚肌胞苷酸诱导模型操作简单，且能出现肝脏以外自身免疫表现，故可用于分析PBC早期肝组织淋巴细胞浸润情况，也可用于新型药物的研发和治疗方案的筛选。Li等［9］发现，沉默信息调节因子1激活剂白藜芦醇可显著改善肝损伤与降低转氨酶水平，提示激活沉默信息调节因子1信号通路可能是PBC治疗的新靶点。但该模型无明确的雌性优势，肝脏病理与人类PBC也有较大区别，并没有出现肉芽肿和嗜酸粒细胞。

2 生物诱导类小鼠模型

2.1 新鞘脂菌诱导模型 新鞘脂菌是一种可以代谢血红蛋白和雌性激素的细菌，被认为是PBC的重要致病因素，其两种蛋白质氨基酸序列与人抗丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(pyruvate dehydrogenase complex E2，PDC－E2)的主要免疫原性脂化结构呈高度同源性［10］。

有研究者将新鞘脂菌5×107CFU(菌落形成单位)静脉注射到C57BL/6、NOD和SJL系小鼠体内发现，其均表现出类似PBC的慢性病变［11］。新鞘脂菌诱导的小鼠模型产生了针对PDC－E2的IgG和IgA抗体;病理显示门静脉炎症伴大量淋巴细胞浸润、胆管损伤和胆囊破坏以及肉芽肿形成［11］。Arsenijevic等［12］发现，半乳凝素－3缺失和半乳凝素－3抑制剂均可减轻新鞘脂菌诱导模型的胆管损伤，提示抑制半乳凝素－3可能是PBC的潜在治疗策略。

新鞘脂菌诱导模型造模时间短，出现特异性的抗体，且病理表现与人类极为相似，但同样无雌性优势，也未出现肝纤维化表现。

2.2 大肠埃希菌诱导模型 PBC发病可能与病原微生物感染有关，病原微生物通过分子模拟自身抗原来诱发自身免疫反应。人PDC－E2与大肠埃希菌PDC－E2具有交叉识别机制［13］，高度相似的非PDC－E2微生物序列存在于大肠埃希菌等细菌内。

研究者给NOD.B6 Idd10/Idd18小鼠静脉注射大肠埃希菌，小鼠出现了AMA和胆管损伤，肝脏病变与人类PBC门静脉浸润十分相似，血清中检测到PDC－E2和2－酮戊二酸脱氢酶复合体E2亚基抗体，其中PDC－E2抗体在感染4周后达到高峰［14］。但该模型注射大肠埃希菌19周后并未出现显著的肝脏病理改变，直到26周才观察到明显的门静脉炎症并伴有肉芽肿形成，不同程度的胆管细胞损伤，部分胆管有轻微的淋巴样细胞浸润，而部分胆管上皮细胞完全消失。

大肠埃希菌诱导模型常用于发病危险因素的研究，除家族遗传等因素外，尿路感染也是其发病因素［10］。通过大肠埃希菌尿路感染诱导的小鼠模型发现，其组织学和免疫学特征与PBC患者相似，包括胆管破坏、肉芽肿形成和淋巴细胞浸润［15］。

3 基因修饰类小鼠模型

3.1 NOD.c3c4小鼠模型 NOD小鼠模型是一种成熟的自身免疫1型糖尿病动物模型，NOD.c3c4来源于NOD小鼠，具有异常的细胞增殖和无细胞凋亡特性，有助于胆管囊肿的形成，这一缺陷加速了小鼠的自身免疫反应［16］，模拟了PBC患者的某些特征。NOD.c3c4小鼠体内可出现AMA、抗核抗体和抗－Sm抗体，血清中丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平均升高。病理可观察到早期囊肿形成和淋巴细胞浸润，主要为CD3+、CD4+和CD8+淋巴细胞。部分小鼠还可观察到嗜酸粒细胞浸润和类似肉芽肿病变。此外，小鼠的胆管疾病可引起肝大甚至肝衰竭，若胆管阻塞还可导致腹水的形成［17］。

Schrumpf等［18］利用此模型衍生了GF(germ free)NOD.c3c4模型，发现胆管反应较轻，提示肠道微生物参与了疾病的发生，但肠道微生物对于疾病的作用仍需进一步探索。Mason［19］发现，抗反转录病毒可显著改善NOD.c3c4小鼠的胆管炎，提示β反转录病毒与胆管炎的发展及线粒体抗体的产生有密切联系。

NOD.c3c4小鼠模型在免疫学、血清学和病理等方面与PBC患者表现有类似之处，适合基因调控等方面的进一步研究。但与人类疾病仍有较大差别，其雌性优势并不十分明显，AMA产生率仅为60%左右，小鼠的病理主要为肝内多囊性病变［17］。

3.2 转化生长因子－β(transforming growth factor－β，TGF－β)Ⅱ型受体显性失活型小鼠模型 TGF－β对免疫稳态和耐受起着关键作用，异常的TGF－β信号分子可导致肝脏自身抗原的耐受性丧失，促进自身免疫疾病的发生。在CD4启动子的控制和缺乏CD8沉默子的条件下，TGF－βⅡ型受体显性失活型小鼠可自发形成类似人类PBC的特征［20］，表明TGF－β参与了PBC的发病机制。

TGF－βⅡ型受体显性失活型小鼠在22～24周时自发产生AMA，且主要为IgA水平升高，IgM水平并没有明显升高。同时，小鼠血清IFN－α、TNF－β、IL－6和IL－12p40等细胞因子水平显著升高。病理方面可观察到汇管区出现中到重度淋巴细胞浸润，以及特征性的单核/巨噬细胞浸润。与PBC患者类似，TGF－βⅡ型受体显性失活型小鼠也发现CD8细胞总数和百分数均升高，CD4+/CD8+T细胞比值下降，并观察到胆管损伤［21］。

研究者在该模型背景下通过基因敲除构建了新的小鼠模型，对研究趋化因子和免疫分子在发病中的机制，临床药物的优化发挥重要作用。Ma等［22］在该小鼠模型基础上敲除CXC趋化因子受体3，发现其促进小鼠CD8+细胞的活化，导致自身免疫性胆管炎的加重;Tsuda等［23］在该模型基础上建立了IL－12p35－/－和IL－12p40－/－小鼠模型，结果发现其肝脏炎症严重程度与原模型相似但却延迟发生;Moritok等［24］探索了新的人源化抗CD20 IgG1抗体对该模型的治疗作用，发现其较抗人CD20的嵌合抗体改善效果更为明显，提示药物疗效不佳的原因可能为体内存在抗药物抗体，从而为临床药物的优化提供新思路。

TGF－βⅡ型受体显性失活型小鼠模型自发产生AMA且阳性率高，与PBC患者有相似的血清学特征，汇管区有淋巴细胞和单核细胞浸润，胆管上皮破坏严重，可以很好地模拟人类疾病。但存在无雌性优势，门静脉区嗜酸粒细胞浸润和肉芽肿形成并不明显，IgA水平升高等与人类疾病不同之处。

3.3 人IL－2受体α敲除(interleukin－2 receptorα－/－，IL－2Rα－/－)小鼠模型 人IL－2Rα－/－小鼠模型血清学AMA阳性，IgG、IgA显著增加，血清辅助性T细胞(helper T cell，Th)1细胞因子(TNF－α、IL－2、IL－12p40、IFN－γ)和Th2细胞因子(IL－6)水平显著升高。病理肝脏汇管区有淋巴细胞和单核细胞中度浸润，小叶间胆管细胞核不规则排列，扭曲的管腔和细胞脱离基膜，与PBC患者慢性非化脓性破坏性胆管炎表现相似。门静脉浸润大量的CD8+和CD4+细胞，且以CD8+细胞为主［25］。

近年来，IL－12被认为与PBC有密切联系，如Yao等［26］构建的IL－12p40－/－IL－2Rα－/－小鼠模型表现出更严重的门静脉炎症和胆管损伤。为探索不同T细胞在PBC发病机制中的作用，Hsu等［27］构建了IL－2Rα－/－CD4－/－和IL－2Rα－/－CD8－/－模型，结果发现前者胆管损伤加重，结肠炎症减轻，而后者相反，提示CD8+T细胞介导胆管损伤，CD4+T细胞介导结肠特异性免疫反应。

IL－2Rα－/－小鼠模型可以很好地模拟早期PBC的肝汇管区炎症与胆小管破坏，产生的AMA可结合到自身抗原的内部硫辛酸结构域。但该模型年龄与性别无差异，也没有肉芽肿和嗜酸粒细胞浸润;此外还会合并其他自身免疫性疾病［25］，如溶血性贫血、急性结肠炎等，导致过早死亡，因此该模型并不是PBC的特异性模型。

3.4 Scurfy小鼠模型 调节性T细胞(regulatory T cell，Treg细胞)在自身免疫病中发挥抑制疾病的作用，而叉头框蛋白3对Treg细胞的生长、稳定和功能非常重要。Scurfy小鼠是通过叉头框蛋白p3基因突变，导致Treg细胞功能缺失而建立的小鼠模型［28］。

Scurfy小鼠模型可产生AMA，IgM、IgA及IFN－γ、IL－6、IL－12p40、IL－18和IL－10等细胞因子水平升高。病理出现PBC样门静脉炎症和胆管损伤，小叶间胆管淋巴细胞浸润和退行性病变，肝脏病理中可观察到中性粒细胞、嗜酸粒细胞和组织细胞浸润［28］。

Scurfy小鼠模型在血清学和病理上与PBC十分相似，对于进一步研究Treg细胞在疾病机制中的作用有重要意义。但该模型与人类疾病仍有许多不同之处［28］，如没有产生肉芽肿，小鼠寿命极短，只有4周左右［29］，且雄性失去生育能力等。

3.5 阴离子交换蛋白2(anion exchanger 2，AE2)a，b－/－小鼠模型 AE2参与细胞内pH调节和经上皮酸碱转运，刺激胆汁性碳酸氢盐排泄，AE2损伤可致胆管上皮细胞损伤与对胆管炎诱导的凋亡敏感［30］，也可诱导自噬失调［31］使模型出现类似PBC的特征。

AE2a，b－/－小鼠模型大多产生了针对PDC－E2的AMA，血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶，以及IFN－γ和IL－12p70等细胞因子水平升高。该模型出现了胆汁淤积性肝损伤的表现，约90%出现了门静脉炎症，同时还出现轻微的纤维化和炎症浸润，浸润细胞主要为单核细胞。损伤的胆管周围出现CD4+T和CD8+T细胞，且以CD8+T细胞为主［29］。

AE2 a，b－/－小鼠模型在免疫和形态学上与PBC患者类似，均有AMA产生和一些细胞因子水平的升高，还出现了CD8+T细胞的增多和Treg细胞的减少，门静脉区炎症细胞浸润。但该模型同时也存在无雌性优势、实验环境和实验成本较高，且存在合并其他疾病和难以繁衍的问题［29］。

3.6 腺嘌呤尿嘧啶富含元件敲除(adenylate uridylaterich element del，ARE_Del－/－)小鼠模型 ARE_Del－/－小鼠模型是通过敲除IFN－γ基因3＇非翻译区中具有162 nt的ARE而建立［32］。敲除ARE后导致IFN－γ的长期慢性表达，而IFN－γ可能在PBC启动阶段对胆管上皮细胞发挥致病作用。

ARE_Del－/－小鼠模型在8～10周时，即可检测到AMA，血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶明显升高，总胆汁酸升高;20周时，出现中到重度门静脉淋巴浸润，门静脉和小叶炎症，小胆管损伤和肉芽肿形成。小鼠胆管破坏与年龄有关，肝脏呈现轻度纤维化［33］。作为少有的具有雌性优势的小鼠模型，推测与IFN信号有关。Bae等［33］发现，雌性小鼠Th1细胞介导的信号通路高度上调，提示可能与IFN－γ通过CD4+T细胞激活的Th1细胞反应有关。随后他们将该模型与IFNⅠ型受体α链基因敲除小鼠杂交发现，ARE_Del－/－IFNⅠ型受体α链基因敲除小鼠的性别优势消失，进一步证明了IFN信号与PBC雌性优势相关［34］。

ARE_Del－/－小鼠模型体内出现针对PDC－E2等的自身抗体，胆管破坏与年龄有关，有明显的雌性优势。但门静脉炎症和肝实质炎症主要由CD4+T细胞引起，与PBC患者的CD8+T细胞浸润不同。此外，还存在肝纤维化程度较低、模型特异度不高等问题［34］。

4 联合构建小鼠模型

针对化学诱导小鼠模型存在诱导时间过长与病理表现较轻的不足，Ambrosini等［35］将2－辛炔酸与聚肌胞苷酸两种药物进行联合免疫实验，发现与2－辛炔酸单独免疫组相比，联合免疫组血浆中的AMA水平并未增加，但血浆中的IFN－γ、TNF－α、IL－12p40和IL－6等细胞因子水平显著升高;同时，联合免疫小鼠肝脏中CD8+T细胞浸润显著增加。联合免疫1周后，自然杀伤细胞的活性显著增强。与单独免疫小鼠相比，联合免疫小鼠的表现更接近PBC患者，这可能由于联合免疫小鼠在自身免疫耐受丧失的基础上进行了二次打击，更真实地模仿了人类疾病［35］。此外，除了不同化学诱导之间的联合免疫，也有学者尝试使用化学与生物诱导联合免疫，但与单独诱导小鼠相比，大肠埃希菌与聚肌胞苷酸联合诱导小鼠在生物化学、组织学等方面并无明显差异［36］。

5 小 结

PBC的病因及发病机制目前尚不明确，故很难通过动物模型来完全模拟PBC。大多数模型与人类疾病相比均存在模拟程度不足、病变较轻的缺陷。在实际应用中，需根据研究内容来选择合适的动物模型。虽然基因修饰类小鼠模型在疾病发生机制中提供了许多新思路，但价格与寿命限制了其广泛使用。药物诱导小鼠是最常用的模型，但也存在造模时间过长、造模成本过高的问题。未来应在深入研究疾病机制的基础上，构建新的小鼠模型，以更好地模拟疾病特征，同时兼顾时间与造模成本，不同造模方法之间的联合可能是一个新思路。