吴闯,韩昌鹏,汪庆明,张海岩
(1.上海市宝山区中西医结合医院肛肠科,上海201999;2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院肛肠科,上海200437)
炎性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn's disease,CD)。UC和CD均是由肠道特异性免疫调节异常导致的炎症性疾病,且病程缠绵,极易反复,难以治愈。研究发现,肠道黏膜屏障损伤及炎症的发生机制均与线粒体自噬密切相关[1]。线粒体自噬是指细胞在受到活性氧类(reactive oxygen species,ROS)、细胞衰老、营养缺乏或者细菌、病毒感染等刺激后,细胞内线粒体通过去极化清除多余或受损线粒体的过程。线粒体的功能障碍可促进炎症的发生、氧化应激并诱导细胞凋亡[2]。其中,ROS和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体与线粒体自噬在UC中的作用已被证实[3]。UC和CD的多个易感基因位点均与线粒体自噬密切相关[4]。药物治疗IBD可能通过调控线粒体自噬起作用[5]。目前关于CD与线粒体自噬的研究较少,但自噬相关基因多态性与CD的发病确实存在联系。线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)突变对线粒体自噬的影响以及线粒体自噬、mtDNA对IBD炎症的发生和免疫紊乱的作用也受到越来越多的关注。现就IBD与线粒体自噬的相关研究进展予以综述。
1.1 线粒体功能 线粒体是真核细胞进行氧化代谢的场所,也是一种可控制细胞代谢、信号转导、分化、生长、凋亡和死亡的重要细胞器,可通过三羧酸循环、氧化磷酸化产生ATP为细胞提供能量,也能储存钙离子调控膜电位,控制细胞凋亡。线粒体是产生ROS的主要亚细胞结构,有10多个位点[6];线粒体ROS产生过多,其强氧化性可破坏mtDNA和蛋白质,导致线粒体损伤、坏死,甚至诱发基因突变、细胞因子异常表达、炎症反应以及免疫系统的异常激活,进一步增加线粒体ROS生成[7]。适时清除衰老或受损的线粒体对细胞具有保护作用。
1.2 线粒体自噬途径 线粒体自噬的作用(促进或抑制细胞死亡)目前尚不明确。由于去极化,线粒体可通过释放促凋亡蛋白而激活细胞凋亡通路。有实验证据表明,重要的自噬基因缺失以及溶酶体功能破坏均可促进细胞发生依赖于胱天蛋白酶(caspase)的凋亡[8-9]。由此可见,若细胞通过自噬清除衰老或功能障碍的线粒体,则线粒体自噬将对细胞起到保护作用。正常细胞清除受损或衰老线粒体的途径主要包括:①可逆性损伤发生时,有缺陷的线粒体被ATP酶降解为小肽,未折叠的线粒体蛋白通过蛋白酶系统被靶向降解[10];②丧失功能的线粒体被选择性地隔离并通过线粒体自噬传递至溶酶体降解[11]。
自噬是细胞内的主要降解途径,可将胞内物质运输至溶酶体内降解。自噬主要有3种形式:大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬[12]。大自噬是一种选择性的大细胞自噬,其特征是形成一个自噬体的双膜囊泡,最终通过融合将线粒体转移至核内的溶酶体[13]。小自噬是指线粒体被直接隔离到核内溶酶体中,在无自噬体形成的情况下进行降解[14]。分子伴侣介导的自噬仅发生于哺乳动物细胞内,通过溶酶体途径选择性降解胞质中的热激蛋白70,进而介导线粒体自噬[15]。
1.3 线粒体自噬的信号转导途径 线粒体自噬主要包括人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因诱导的假定激酶1(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten induced putative kinase 1,PINK1)-Parkin信号转导通路和受体介导的线粒体自噬。Parkin是由PARK2基因编码的一种蛋白,具有E3泛素-蛋白连接酶活性。而Parkin会被PINK1磷酸化,促进Parkin由胞质转至线粒体,PINK1和Parkin蛋白可降低线粒体膜电位,引起线粒体自噬[16]。Parkin能够被选择性地募集到膜电位降低的线粒体,并且介导线粒体被自噬体包裹形成一种双膜结合的囊泡(自噬体),而适配器蛋白[如自噬蛋白p62、视神经病变诱导反应蛋白(optineurin,OPTN)、核点蛋白52(nuclear dot protein 52,NDP52)]可识别线粒体蛋白上的磷酸化多聚泛素链,并通过与微管相关蛋白1A/1B轻链(light chain,LC)3结合形成自噬体[17]。TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1)可通过磷酸化OPTN形成OPTN-TBK1复合物,从而建立促进线粒体清除的反馈机制[18]。PINK1-Parkin线粒体泛素化途径还会招募OPTN/NDP52并激活TBK1,促进线粒体自噬,其中还需要OPTN、NDP52和自噬蛋白p62/SQSTM1(sequestosome-1)的参与[19]。
蛋白折叠是维持细胞功能的关键,分子伴侣蛋白可介导线粒体维持细胞功能和内稳态平衡[20]。Li等[21]研究发现,线粒体膜外自噬受体蛋白FUN14结构域蛋白1与热激蛋白70相互作用,通过线粒体外膜转移酶/线粒体内膜转移酶复合物介导细胞质蛋白酶体底物的线粒体易位,进入线粒体内被Lon线粒体蛋白同源物1蛋白酶降解;线粒体内未折叠蛋白的过度积累可触发线粒体相关蛋白聚集体形成,并以FUN14结构域蛋白1依赖性方式自噬降解。
Nix是介导线粒体自噬的重要蛋白,Nix高表达可引起线粒体膜电位变化[22],从而激活Pink1-Parkin通路诱导线粒体自噬。有研究显示,Nix可调控Parkin向线粒体募集,激活Parkin-Ubiquitin-p62,介导线粒体自噬[23]。Nix还能招募微管相关蛋白轻链识别序列模体自噬相关蛋白(autophagy,Atg)8家族成员LC3A、γ-氨基丁酸受体相关蛋白、γ-氨基丁酸受体相关蛋白L1、γ-氨基丁酸受体相关蛋白L2相互作用,诱导线粒体自噬[24]。同时,Nix还可增加细胞质中游离的Beclin-1水平,其机制是唯BH3域蛋白与Beclin-1竞争Bcl-2或Bcl-xL,从而提高细胞质中Beclin-1水平,而Beclin-1是参与自噬泡生成的重要蛋白,且Bcl-2或Bcl-xL与Beclin-1的结合产物可抑制自噬[25]。另有研究显示,细胞中缺乏Nix时,细胞内线粒体自噬泡水平并不受影响[26]。因此,线粒体自噬可能还存在其他途径,未来需深入研究。
线粒体自噬参与许多自身免疫性疾病的发病,也与炎症性疾病密切相关。有研究表明,UC患者肠黏膜上皮通透性增加,肠黏膜屏障损伤可能是导致其发病的一个重要因素[27]。肠上皮细胞黏膜屏障功能完整性的维持依赖于能量供应,而线粒体功能可能是保护肠上皮细胞黏膜屏障功能的关键[28]。UC的发病受mtDNA和细胞核DNA的双重调控[29]。线粒体功能障碍导致肠上皮细胞受损(如Paneth细胞、杯状细胞功能障碍甚至缺失),进而导致肠上皮细胞屏障功能降低、通透性增加,刺激肠道炎症发生[30]。
2.1 UC与Atg、ROS的关系 UC发病及其病情程度与多种自噬蛋白、ROS增多相关。线粒体的降解与一系列Atg密切相关,如Atg32[31]、Atg8[32]和Atg11[33]可作用于线粒体表面,并促进线粒体中核心Atg蛋白的组装,而p62/SQSTM1与吞噬线粒体膜表面Atg8同源蛋白LC3结合诱导形成自噬泡,从而诱导线粒体分解[34]。研究显示,葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium salt,DSS)可诱导UC小鼠结肠组织中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β表达上调,而LC3B、p62以及Atg7的表达均下调[35]。Atg7、LC3B主要用于检测自噬活性,p62作为自噬底物,其水平可作为自噬水平的指征。
线粒体是ROS产生的主要场所,在细胞死亡中发挥核心作用。有研究发现,UC患者的血浆、血清,甚至其呼出气体和唾液中均可检测到高浓度的氧化分子,且UC的严重程度与氧化应激呈正相关[36]。长时间的氧化应激可降低线粒体的生物功能和稳态,促进细胞损伤,并最终导致细胞死亡[30]。线粒体是细胞内ROS产生的主要场所,但不是唯一场所。目前关于激活肠炎的ROS来源仍存在争议。但有研究显示,ROS对于肠道可能具有一定的正向作用[37]。
2.2 UC中线粒体自噬与炎症因子的关系 细胞ROS异常还与某些炎症因子有关。Dashdorj等[38]研究发现,在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中,小鼠结肠和小肠黏膜中的过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶水平均显著低于肝脏组织,而应用线粒体靶向抗氧化物MitQ治疗后,线粒体中ROS以及IL-1β、IL-18的表达水平降低。而IL-1β不仅可促进炎症,还可增加结肠黏膜的通透性[39]。Wang等[40]通过研究猴头菌多糖对结肠炎大鼠的治疗作用发现,猴头菌多糖可通过抑制肠炎小鼠细胞线粒体ROS水平降低TNF-α、IL-6、IL-8和核因子κB p65的表达,从而减轻炎症反应;且DSS诱导的大鼠模型线粒体均呈嵴塌陷、膨胀和破碎状态,其膜电位变化较正常小鼠减少70%。综上,UC的发生可能与细胞ROS水平异常、线粒体自噬密切相关,但ROS变化与线粒体自噬是否为导致炎症的关键因素目前仍不清楚。
2.3 UC中线粒体自噬与NLRP3炎症小体的关系UC中线粒体自噬还与炎症小体相关,UC患者肠道或血清中的NLRP3水平显著升高[41]。线粒体可以通过激活炎症小体的分子复合物调节细胞的促炎反应。细胞外ROS、mtDNA、ATP刺激或细胞内(如线粒体损伤)产生的ROS、活性氮均可导致NLRP3与凋亡相关斑点样蛋白形成复合物,该复合物进一步募集前体caspase-1形成活性NLRP3炎症小体,刺激caspase-1裂解,释放活化的IL-1β和IL-18[42]。Banoth和Cassel[43]发现,线粒体还可通过模式识别受体进行信号转导,诱导肠道炎症的发生。此外,当线粒体被破坏或突变时,可导致过度的氧化应激抑制ATP的产生,进而导致代谢链抑制和mtDNA破坏[44]。
2.4 UC与mtDNA的关系 UC的发生可能与mtDNA突变有关。Boyapati等[45]发现,UC患者结肠黏膜中的线粒体损伤明显,患者粪便中的mtDNA水平显著升高;同时,DSS诱导的急性结肠炎小鼠血浆中的mtDNA水平也显著升高,且与炎症程度呈正相关;与健康人群相比,UC和CD患者结肠黏膜中的Toll样受体9以及固有层炎症细胞显著升高,可能由于UC中线粒体裂解增加,可在细胞中检测到更多的mtDNA。mtDNA是Toll样受体9的激动剂,mtDNA-Toll样受体9模式在肠道黏膜炎症发生中具有重要作用。mtDNA突变还可能促进UC患者癌变,但已癌变患者中的mtDNA突变不明显[37]。然而,Tanaka等[46]发现,UC癌变患者肠黏膜非肿瘤区mtDNA突变显著。因此,UC的发生可能是由于某些信号分子导致细胞或线粒体内ROS、mtDNA以及其他相关基因突变,扰乱了正常的线粒体代谢途径和线粒体自噬过程,但确切途径目前仍不清楚,未来仍需更多的研究证实。
CD病理可以影响肠道的任何部位,包括回肠末端,病变可累及肠壁深层。CD和UC具有共同的疾病易感性和共同的基因图谱。潘氏细胞受损和减少是CD肠道病理发生的重要机制。Khaloian等[47]敲除小鼠TNF基因3'端富含AU的60 bp片段后建立回肠炎小鼠模型,结果发现,小鼠回肠炎症与潘氏细胞中的溶菌酶和隐窝中的亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5的减少均呈负相关;而肠道干细胞中热激蛋白60的缺失可导致线粒体的代谢障碍。Jackson等[48]也发现,线粒体功能障碍可导致潘氏细胞中的线粒体内膜抗增殖蛋白减少,从而增加CD患者的回肠炎症。
3.1 CD中线粒体自噬与炎症的关系 CD患者肠道上皮单核吞噬细胞中发生的炎症刺激源于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶亚基的突变[49]。Pierre等[50]研究显示,CD患者回肠及结肠中的线粒体蛋白丰度显著低于正常人群。CD患者回肠中电信号的高线粒体活性还与CD病程的防御有关[51]。OPTN蛋白是OPTN基因编码的577aa蛋白,其与CD密切相关[52]。OPTN是线粒体自噬PINK1-Parkin通路的依赖性受体,OPTN基因的启动子上有核因子κB结合位点,可启动促炎因子的表达,而受损线粒体被清除会限制炎症自噬受体p62参与核因子κB表达的过程[53]。但有研究显示,p62在PINK1-Parkin通路中并不是必需的[10]。
3.2 CD中基因突变与线粒体自噬的关系 IL-10受体α基因、IL-10受体β基因、核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2基因、X染色体连锁凋亡抑制蛋白基因、细胞凋亡抑制蛋白2基因、免疫相关GTP酶家族M蛋白1基因、X盒结合蛋白1等基因突变的机制可能是线粒体自噬的缺失[54-55]。有研究显示,X染色体连锁凋亡抑制蛋白基因突变人群易患CD[56]。CD患者的核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2基因也通常发生突变[57]。细胞凋亡抑制蛋白2和X染色体连锁凋亡抑制蛋白均可促进自噬体-溶酶体融合导致线粒体自噬[58]。自噬基因Atg16L1的多态性与CD相关,缺乏Atg16L1的肠黏膜出现潘氏细胞缺失,并表现出TNF介导的细胞坏死,而TNF-α或受体相互作用蛋白激酶抑制剂则可减轻IBD模型的炎症[59]。Zhang等[60]研究表明,Atg16L1缺乏可导致巨噬细胞功能改变,加重CD病情。Liu等[61]通过敲除DSS诱导的结肠炎小鼠的免疫相关GTP酶家族M蛋白1基因发现,免疫相关GTP酶家族M蛋白1基因可能通过调节肠上皮细胞及潘氏细胞中的线粒体自噬过程调节小鼠肠道的急性炎症反应。
IBD是由肠上皮细胞能量缺失导致的疾病,与肠上皮细胞的线粒体损伤密切相关。尽管目前尚无证据表明线粒体自噬与IBD存在因果关系,但线粒体自噬与IBD确实存在潜在联系。多种刺激和环境条件均可扰乱线粒体功能,但IBD肠道线粒体应激的主要刺激因素目前尚未明确。而肠上皮细胞中的线粒体自噬是肠道免疫失常和炎症过程主要的诱发因素。外来刺激或基因突变等可能是导致线粒体功能障碍、自噬失调的诱发因素,线粒体功能障碍及自噬失衡会影响细胞的正常代谢,导致肠上皮的通透性增加。外来刺激或基因突变与肠道其他因素(如微生物群)相互作用导致肠上皮的通透性增加,共同作用导致IBD发生。目前线粒体自噬在IBD中的作用研究仍处于初级阶段,未来仍需深入的研究阐明线粒体自噬在IBD发病中的作用机制。