新型免疫分子TIM-4的结构、配体及其在恶性肿瘤中的研究进展

池艳琳，卿吉琳，陈柳燕，黄小妹，陈治中

(1.广西中医药大学第一附属医院检验科，南宁530023;2.广西中医药大学瑞康临床医学院，南宁530011;3.广西壮族自治区人民医院a.生殖医学中心，b.精准联合检验中心，南宁530021)

我国恶性肿瘤的发病率及病死率均高于世界平均水平，女性恶性肿瘤的发病率明显高于男性［1］。恶性肿瘤负担的持续加重，对公众健康构成重大威胁。目前用于临床恶性肿瘤辅助诊断和预后判断的高敏感性和高特异性的肿瘤标志物有限，为了实现恶性肿瘤的早诊断、早治疗，改善患者预后，提高肿瘤免疫治疗的临床疗效，寻找新型的肿瘤标志物迫在眉睫。

人类T细胞免疫球蛋白黏蛋白(T－cell immunoglobulin mucin，TIM)基因家族成员包括TIM－1、TIM－3和TIM－4。TIM－4选择性表达于抗原呈递细胞表面，特别是活化的树突状细胞以及巨噬细胞表面。多项研究表明，TIM－4基因在结直肠癌［2］、肺癌［3］、宫颈癌［4］、肾癌［5］、神经胶质瘤［6］等肿瘤中均有表达。TIM－4可表达于树突状细胞来源的恶性肿瘤、恶性组织细胞肉瘤以及朗格汉斯细胞肉瘤，且咽旁脂肪肉瘤中也存在TIM－4的表达。TIM－4基因可能参与多种肿瘤的增殖、转移进程。现就TIM－4的结构、配体及其在肿瘤中的研究进展予以综述。

1 TIM-4概述

1.1 TIM－4基因的结构 TIM－4是TIM基因家族的Ⅰ型细胞表面糖蛋白，由信号肽、胞外N端免疫球蛋白可变区(immunoglobulin variable，IgV)样结构域、黏蛋白样结构域、跨膜结构域和胞质内尾组成。在TIM家族成员中，TIM－4基因片段最长，含有大量苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸片段，细胞内区域包含42～77个氨基酸，是小鼠和人类同源物中高度保守的区域［7］。TIM－4胞内结构域缺少酪氨酸活化残基，可能无法直接介导信号转导，故可通过TIM－4胞外N端IgV样结构域作为介导信号转导的载体实现间接信号转导。TIM－4的IgV样结构域被广泛研究，该结构域有两个关键位点:①与磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)结合的口袋FG－CC＇环可识别并结合凋亡细胞［8］;②与整合素结合的精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸(Arg－Gly－Asp，RGD)基序可介导细胞的迁移和黏附［3］，这两个位点可能是TIM－4实现介导凋亡细胞吞噬、参与肿瘤侵袭转移等功能的关键结构。

1.2 TIM－4的表达与功能 TIM－4是一种PS受体，选择性表达于巨噬细胞、树突状细胞等抗原呈递细胞［7］。TIM－4基因通过介导去除抗原特异性T细胞的适应性免疫，可能在调节免疫功能中发挥重要作用［9］。TIM－4与TIM－1结合可参与抗原呈递细胞T细胞的相互作用，为T细胞的活化提供共刺激信号，参与T细胞增殖的调控。T细胞又称胸腺依赖性淋巴细胞，T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫的形式主要有两种:①与靶细胞特异性结合破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞;②释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强。因此，TIM－4基因可通过调控T细胞增殖间接参与免疫调节。

此外，TIM－4对于清除体内凋亡体至关重要，TIM－4缺乏导致凋亡异常持续，使淋巴细胞激活异常。研究显示，TIM－4可介导凋亡细胞的吞噬作用［10］。TIM－4的IgV结构域FG－CC＇环与凋亡细胞表面的PS结合，将凋亡细胞固定在巨噬细胞上，促进巨噬细胞吞噬凋亡细胞。TIM－4具有一定的黏附功能，TIM－4的IgV样结构域中的RGD基序可与整合素结合，介导细胞的迁移和黏附［3］。TIM－4的表达高度局限于髓系细胞，可能在肿瘤微环境中调节髓系细胞和抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的相互作用［11］。而髓系细胞形成的耐受微环境对肿瘤进展和抗肿瘤药物耐药性的诱导至关重要。由此可见，TIM－4基因在多种肿瘤中表达，可参与免疫调节、介导凋亡细胞的吞噬作用、介导细胞的迁移和黏附。对肿瘤中TIM－4基因的深入研究可能有助于调节肿瘤微环境，为肿瘤免疫治疗提供新思路。

1.3 TIM－4的配体

1.3.1 PS PS是一种膜脂，可在细胞凋亡和(或)细胞应激时外翻至细胞膜外表面。PS属于TIM－4配体，凋亡细胞表面的PS可与TIM－4特异性结合［8］。凋亡细胞表面表达的PS被吞噬细胞通过PS结合蛋白直接或间接识别。PS结合蛋白TIM－4将凋亡细胞固定在吞噬细胞上，促进吞噬凋亡细胞。有研究显示，IgV样结构域缺失后，TIM－4的促吞噬作用完全消失，证实TIM－4主要通过IgV样结构域的结合位点促进巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用［3］，即TIM－4通过其IgV样结构域的FG－CC＇环识别凋亡细胞表面暴露的PS，介导巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬。此外，肿瘤可利用PS外翻信号增强肿瘤的免疫逃逸，因此抑制PS介导的免疫逃逸策略可能提高免疫治疗的疗效。在肿瘤微环境中，PS介导的免疫抑制常被称为凋亡拟态。外化的PS可以驱动胞吐或激活PS受体，促进局部免疫抑制。以PS或激活PS受体为靶点的单克隆抗体已经被开发出来，并正在进行临床前和临床试验［12］。PS外翻是TIM－4促进巨噬细胞吞噬凋亡细胞的关键信号，PS信号亦被用于抗肿瘤免疫治疗研究。

1.3.2 TIM－1 TIM－1是TIM－4的天然配体［9］。TIM－1与TIM－4结合参与抗原呈递细胞T细胞的相互作用，为T细胞的活化提供了共刺激信号，参与T细胞增殖的调控［9］。T细胞产生的细胞免疫应答主要有两种形式:①通过与靶细胞特异性结合破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞;②通过释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强。TIM－1与TIM－4相互作用调节T细胞的增殖和效应功能，这种效应辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞)，尤其是Th2细胞调节上表现更明显。研究表明，TIM－1和TIM－4均可与暴露在凋亡细胞或外泌体上的PS结合，促进巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用［8］。凋亡细胞表面表达PS，被吞噬细胞通过PS结合蛋白直接或间接识别。有研究显示，TIM－4特异性结合TIM－1的作用可被TIM－1抗体抑制，证实TIM－1是TIM－4的天然配体，且TIM－4通过中间载体PS间接与TIM－1发生相互作用，促进了凋亡细胞的清除［9］。

1.3.3 纤维连接蛋白1(fibronectin－1，Fn1) Fn1是一种新型TIM－4结合蛋白，可能是TIM－4基因的配体，Fn1水平的变化可影响TIM－4诱导的胞外增殖，通过破坏TIM－4和Fn1的相互作用则可消除TIM－4介导的胞外增殖;Fn1的水平决定了TIM－4诱导胞外增殖的能力，证实TIM－4与Fn1可直接结合［13］。TIM－4与Fn1直接结合，并通过支架蛋白Fn1与整合素结合形成TIM－4－Fn1－整合素复合物，促使TIM－4与整合素协同作用，从而实现高效的胞外增殖［13］。近年来，人工栓系受体诱导胞外增殖成为研究热点。在同等实验条件下，TIM－4诱导胞外增殖的效果较人工栓系受体(糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白－膜联蛋白A5)更好［13］。因此，Fn1是TIM－4基因的潜在配体，可作为中间载体直接与TIM－4基因结合，连接TIM－4与整合素，在Fn1等辅助机制的作用下，TIM－4的表达能力和作用可能增强，且能够更有效地协同协调凋亡细胞的栓系和摄取，促进凋亡细胞的清除，可用于细胞增多缺陷所致疾病的治疗。

1.3.4 整合素 整合素又称整联蛋白，是一种跨膜的异质二聚体，由两个非共价结合的跨膜亚基(即α和β亚基)组成，可能是TIM－4基因的潜在配体。整合素糖基化的α和β链通过非共价键结合。TIM－4通过载体Fn1与整合素αvβ3紧密定位结合，使TIM－4与整合素协同作用，实现高效的胞外增殖［13］;TIM－4通过IgV结构域中固有的RGD基序与整合素蛋白结合并相互作用，提示TIM－4可能具有一定的黏附功能［3］。TIM－4可通过Fn1和RGD基序两条途径与整合素结合。实验证明，骨桥蛋白中的RGD基序通过与整合素αvβ3的相互作用控制肿瘤生长［14］。研究证实，过表达TIM－4通过IgV结构域的RGD基序促进S期肺癌细胞的生长、增殖和积累［3］，说明TIM－4可能通过与整合素结合直接或间接参与肿瘤的发生发展。通过调节TIM－4与整合素的结合有望控制肿瘤的生长，且有助于肿瘤患者的免疫治疗。

1.3.5 白细胞单免疫球蛋白样受体5(leukocyte mono－immunoglobulin－like receptor 5，LMIR5) LMIR5是LMIR家族的成员之一，其本质是一种主要表达于髓细胞的分子量为12 000的DNAX活化蛋白偶联活化受体。LMIR5可能是TIM－4的内源性配体，可结合TIM－4;TIM－4与LMIR5的结合位点可能与PS的结合位点十分靠近，且LMIR5与TIM－4结合的亲和力较PS与TIM－4结合的亲和力更低，故LMIR5与TIM－4在PS结合位点附近结合对TIM－4介导的凋亡细胞吞噬作用无影响;但是肥大细胞具有弱吞噬功能，说明LMIR5与TIM－4结合间接参与凋亡细胞的清除［15］。因此，LMIR5可能是TIM－4的内源性配体，LMIR5与TIM－4结合并诱导激活表达LMIR5的肥大细胞，肥大细胞激活并脱颗粒释放生物活性介质，在组织内引起速发型超敏反应，说明TIM－4可能间接参与过敏性疾病以及免疫性疾病的发生发展。

2 TIM-4与恶性肿瘤

2.1 TIM－4与消化系统肿瘤

2.1.1 TIM－4与结直肠癌 消化道恶性肿瘤在我国高发，且发病率及病死率呈逐年上升趋势。Tan等［2］研究发现，与邻近正常组织相比，结直肠癌小鼠模型的结直肠癌组织中TIM－4的表达明显升高;统计分析显示，TIM－4表达升高与远处转移、TNM分期和结直肠癌患者总生存期缩短密切相关。可见，小鼠结直肠癌模型体内稳定过表达的TIM－4可显著诱导结直肠癌的发生;TIM－4的稳定过表达可使乙醛脱氢酶－1水平升高，表明TIM－4稳定过表达后，癌症干细胞样特性提高，癌细胞通过募集肿瘤相关巨噬细胞促进结直肠癌的进展，且结直肠癌细胞的增殖和肿瘤间质重构增加;此外，磷脂酰肌醇－3－激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路的激活在肿瘤发展中起关键作用。该研究还发现，TIM－4可激活结直肠癌细胞磷脂酰肌醇－3－激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路。综上，TIM－4过表达可通过募集肿瘤相关的巨噬细胞、促进结直肠癌细胞的增殖和肿瘤间质重构、激活磷脂酰肌醇－3－激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，促进结直肠癌的发生发展。TIM－4在相关肿瘤的发生、发展中可能发挥直接或间接的促进作用。

2.1.2 TIM－4与胃癌 胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率较高［16］。TIM－4与TIM－1的相互作用可调节T细胞的增殖和效应功能，这种效应在Th2细胞上更明显。T细胞主要介导细胞免疫，通过与靶细胞特异性结合破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞;或通过释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强。树突状细胞通过TIM－1/TIM－4途径与Th2细胞结合，诱导Th2细胞增殖。Sun等［17］利用体外实验模型将TIM－4的IgV样结构域FG－CC＇环的干扰小RNA转染到经胃癌裂解液刺激的树突状细胞中发现，这些树突状细胞可以抑制胃癌的生长，表明可通过TIM－4基因FG－CC＇环序列－干扰小RNA阻断TIM－4的IgV样结构域的FG－CC＇环，增强树突状细胞疫苗的免疫功能，预防胃癌发生发展。由此可见，TIM－1/TIM－4途径可调节T细胞的增殖和效应功能，故调控TIM－4可能成为增强抗肿瘤免疫、促进肿瘤化疗的一种新策略。

2.1.3 TIM－4与肝癌 肝癌是第五大恶性肿瘤，全球因肝癌死亡人数居癌症致死人数的第2位［18］。Liu等［19］比较未发生脂肪变性与发生脂肪变性的肝癌组织切片免疫组织化学染色发现，与未发生脂肪变性的肝癌癌旁组织相比，发生脂肪变性的肝癌癌旁组织中TIM－4表达水平升高;免疫荧光染色显示，与未发生脂肪变性的肝癌组织相比，发生脂肪变性肝癌组织中TIM－4的表达显著升高，免疫组织化学染色与免疫荧光染色结果一致，进一步证实了结果的可靠性。可见，TIM－4可直接或间接参与脂肪变肝癌的发生，促进脂肪变肝癌的发展，TIM－4可能是肿瘤调控的潜在靶点，有望成为脂肪变肝癌的特异性肿瘤标志物。

2.2 TIM－4与肺癌 肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤之一，也是主要的癌症死亡原因［20］。肺癌以非小细胞肺癌(non－small－cell lung cancer，NSCLC)最常见，患者5年生存率低，Ⅰ～ⅢA期占14%～49%，ⅢB～Ⅳ期占比＜5%［21］。有学者对TIM－4在NSCLC中的表达及其作用机制进行研究。Zhang等［3］研究发现，TIM－4在NSCLC组织中的表达明显高于癌旁组织;且TIM－4表达水平升高与NSCLC组织分化及患者生存时间呈负相关;过表达TIM－4可促进NSCLC细胞的生长和增殖，突变TIM－4分子结构中RGD基序可弱化TIM－4对NSCLC细胞增殖的促进作用;进一步通过免疫共沉淀分析发现，TIM－4通过RGD基序与整合素αvβ3相互作用，最终实现高效的胞外增殖。可见，TIM－4可通过RGD基序促进NSCLC细胞的生长和增殖，还可通过RGD基序与整合素结合而发挥相互作用。TIM－4可能是肺癌的潜在生物标志物和治疗靶点，也可能是NSCLC患者的不良预后指标。

2.3 TIM－4与宫颈癌 宫颈癌是女性最常见生殖系统肿瘤之一，患者3～5年生存率低于50%［22］。TIM－4可能是宫颈癌靶向治疗的重要靶点，可能参与宫颈癌的发生发展。王速捷等［4］通过免疫组织化学法检测宫颈癌肿瘤组织及癌旁组织中TIM－4的表达发现，宫颈癌组织标本中的TIM－4表达水平明显上调，且TIM－4表达水平与患者3年生存率呈负相关;进一步检测血清分泌型TIM－4水平发现，宫颈癌患者外周血血清TIM－4水平较正常对照者明显上调;并且TIM－4可能与肿瘤淋巴结转移有关。可见，TIM－4参与了宫颈癌的发生、发展，可能是宫颈癌靶向治疗的重要靶点。

2.4 TIM－4与神经胶质瘤 神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的内在恶性原发性肿瘤，其中胶质母细胞瘤恶性程度最高，且耐药性较强，TIM－4的表达水平与胶质瘤密切相关［23－25］。Li等［6］发现，肿瘤组织中TIM－4的表达水平明显高于正常癌旁组织。靶向干扰沉默TIM－4可诱导胶质瘤细胞凋亡，抑制胶质瘤生长，降低胶质瘤细胞的克隆能力;而过表达TIM－4可促进胶质瘤细胞的生长，抑制其凋亡，增强其克隆潜能。研究显示，肿瘤耐受性在肿瘤生长和逃避免疫监视中起重要作用，调节性T细胞在肿瘤耐受中起关键作用，而TIM－4参与免疫调节［26］。胶质瘤来源的巨噬细胞吞噬表达PS的T细胞，获得耐受性，可通过诱导肿瘤特异性调节性T细胞抑制肿瘤特异性CD8+T细胞。因此，巨噬细胞衍生的TIM－4在胶质瘤的调节性T细胞诱导中起重要作用，TIM－4高表达的胶质细胞源性巨噬细胞通过吞噬T细胞促进肿瘤耐受。TIM－4有望成为脑胶质瘤新的标志物及肿瘤治疗的新靶点。

2.5 TIM－4与肾癌 肾癌是泌尿系统的主要恶性肿瘤之一，以肾透明细胞癌(renal clear cell carcinoma，RCC)最常见［27］。RCC往往较易复发，且预后较差。为了降低复发率、改善患者预后、提高患者生活质量，需要寻找新的靶点与治疗策略以达到更好的治疗效果。Yano等［5］对89例RCC患者的组织标本进行免疫组织化学染色发现，癌细胞中TIM－4的高表达与患者生存时间短密切相关，且RCC细胞株(786－O、A498、ACHN和CAKI－1)中TIM－4信使RNA的表达水平均升高;沉默细胞表达后发现，786－O细胞株中TIM－4的表达下降，且TIM－4高表达与RCC患者的不良预后直接相关，进一步的体外研究证实，干扰TIM－4表达可提高肾癌细胞对索拉非尼的敏感性。因此，TIM－4可能参与肾癌细胞的增殖、转移，可能成为一种有用的肾癌预后判断因子，有望成为治疗RCC的新靶点，也可能是观察肾癌患者疗效的新指标。

2.6 TIM－4与黑色素瘤 恶性黑色素瘤致死率高，极易发生转移，目前缺乏有效的治疗方法。TIM－4在黑色素瘤中也有相关研究。单克隆抗体特异性靶向TIM－4或TIM－3可以增强免疫接种对小鼠黑色素瘤的治疗效果［28］。抗TIM－3单克隆抗体能够提高肿瘤浸润性自然杀伤细胞的数量和活性，而抗TIM－4单克隆抗体主要招募CD8+T细胞作为抗肿瘤活性的来源。TIM－4与TIM－3单克隆抗体联合阻断可以提高肿瘤疫苗对已形成的黑色素瘤的疗效。TIM－4有望成为抗肿瘤治疗的新靶点，TIM－4单克隆抗体可参与提高肿瘤疫苗的疗效，为肿瘤的免疫治疗提供新思路。

2.7 TIM－4与其他肿瘤 TIM－4在其他恶性肿瘤中也有重要作用。有研究对1例30岁男性咽旁脂肪肉瘤(罕见疾病)患者术后肿瘤组织的免疫组织化学法检测发现，咽旁脂肪肉瘤细胞膜和细胞质中均有TIM－4表达［29］。TIM－4在朗格汉斯细胞肉瘤组织切片中表达，免疫荧光双染色实验显示，TIM－4与Langerin共表达于朗格汉斯细胞的细胞膜和细胞质上，而Langerin是检测朗格汉斯细胞肉瘤的潜在生物标志物［30－31］。由此可见，TIM－4可能参与咽旁脂肪肉瘤、朗格汉斯细胞肉瘤的发生发展，可能是咽旁脂肪肉瘤、朗格汉斯细胞肉瘤的新的标志物。

3 TIM-4与肿瘤免疫治疗

免疫治疗通过增强机体对癌细胞的免疫反应消灭敏感癌细胞，抑制肿瘤的生长［32］。免疫治疗可延长恶性肿瘤患者的生存期，为恶性肿瘤的治疗带来了新的希望。靶向FG－CC＇环的干扰小RNA可以提高树突状细胞疫苗对胃癌的免疫效果［17］，因此靶向TIM－4中的FG－CC＇环可能有助于开发新的治疗方法。最新肿瘤实验模型数据发现，肿瘤相关树突状细胞和巨噬细胞TIM－3和TIM－4表达的上调削弱了肿瘤疫苗和化疗的抗肿瘤作用，表明联合抗TIM－3和抗TIM－4单克隆抗体可进一步提高肿瘤疫苗的疗效［33］。TIM－3和TIM－4的治疗操作可能为提高肿瘤免疫治疗的临床疗效提供一种新的策略。TIM－4有望成为恶性肿瘤患者生存时间评估、肿瘤疗效观察和预后改善的指标，可能为实现恶性肿瘤患者精准免疫治疗提供重要靶点。

4 小 结

TIM－4参与调节T细胞增殖，在免疫调控中发挥作用，参与多种免疫性疾病的发展［34－35］，可能成为肿瘤免疫反应的潜在共刺激分子。TIM－4与暴露在凋亡细胞或外泌体上的PS结合，促进巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用。高表达TIM－4的胶质细胞源性巨噬细胞通过吞噬T细胞促进肿瘤耐受。TIM－4通过诱导肿瘤免疫耐受在抗肿瘤免疫中发挥负性作用，抗原呈递细胞过表达TIM－4导致T细胞免疫应答降低，使抗原特异性T细胞数量减少［26］。TIM－4在不同类型肿瘤组织及细胞中均有不同程度的表达，可直接或间接参与肿瘤的侵袭和转移，其与肿瘤的发生发展密切相关，可能成为新的肿瘤标志物。TIM－4可能为增强抗肿瘤免疫、促进肿瘤化疗及免疫治疗提供一种新的策略。