精子DNA碎片检测在辅助生殖中的研究进展

陈云斌

（柳州市人民医院，广西 柳州，545006）

近年来，随着生活方式、饮食结构的不断改变，我国不孕症患病率也随之上升，患病率为10%～15%，而因男性所致不孕高达40%，其中10%正常男性与20%～25%不育男性均伴较为严重的精子DNA 损害[1]。精子DNA 碎片（SDF）检测是常规精液分析中的一项重要补充，其是检测精子功能的重要指标。相关研究显示，SDF 与氧化应激损伤、精子异常、精子凋亡等具有密切相关的联系[2]。SDF 指数（DFI）主要是在多种不利条件下，引起DNA 断裂的精子占全部精子的百分比，其在评估精子DNA 完整性中具有一定的积极作用。相关研究显示，SDF 检测水平对辅助生殖技术(ART)治疗方式产生一定的影响，可指导ART 治疗，但仍存在一定争议，分析原因可能与SDF 阈值相关[3]。

1 SDF 检测方式

1.1 精子染色质结构分析法(SCSA）

SCSA 为DNA 碎片检测的金标准，其主要原理为正常精子DNA紧密结合具有抗酸性，以此保持双链稳定，而遭受损伤的精子DNA 较为疏散，在酸作用下可逐渐形成单链，与双链DNA、吖啶橙相结合，可呈现出绿色荧光，而与单链DNA 相结合，可呈现出红色荧光，最终经过流式细胞仪准确、快速以及客观的对SDF进行测定，具有敏感、结果稳定等特点，可对男性生育能力进行评估。林峰、陈永艳、康跃凡[4]等人研究显示，分析SCSA 检测DFI 与体外受精(IVF)、卵胞浆内单精子注射(ICSI)妊娠结局之间的关联，结果显示，SCSA 检测DFI 对ICSI 的妊娠结局具有一定的预测意义，但对IVF 妊娠结局无预测作用，因此临床仍需纳入更多样本进行研究，以进一步验证。

1.2 单细胞凝胶电泳实验(SCGE)

SCGE 也可称之为彗星实验，主要是由瑞典科学家Ostling、Johanson 1984年发明的对毒物DNA 损伤效应进行检测的一种方式。SCGE 适用于所有存在核细胞的组织，可灵敏检测单链、双链DNA 的断裂，在检测射线、诱变剂等对DNA 的损伤，检测环境污染物对机体造成的损伤等已广泛应用。精子DNA 造受损伤后，其超螺旋结构会发生一定损害，断裂DNA 片段在电场作用下，移动至阳极，进而可形成“彗星”尾，而“彗星”头则是由完整精子DNA 形成。实施SCGE 检测，需要使用的精子量较少，临床可依据电泳液pH 值的不同，对DNA 单链、双链损伤进行有效区分，以此有利于明确不同疾病与不同损伤之间的关联。覃太洲、徐克惠、刘莉[5]等人研究显示，SCGE 技术因能够对DNA损伤类型进行区分，可作为一个有意义的临床辅助诊断工具。但应注意，SCGE 操作具有一定的复杂性，需要实验室工作人员熟练掌握操作技术，同时还应在稳定的实验室环境中与更为敏感智能的图像采集分析系统进行检测，以保障检查结果准确性。

1.3 脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)介导缺口末端原位标记法 (TUNEL)

TUNEL 法以往临床多将其用于检测凋亡细胞DNA 片段中，近年来，随着医学技术不断发展，TUNEL 逐渐应用于评估精子DNA 损伤中。TUNEL 主要是一种以异硫氰荧光素(FITC)为标志物，借助TdT 将带有荧光标记的dUTP 转移至DNA 损伤分子的3'-OH 末端，随后经过显微镜或流式细胞仪对DNA 双链、单链损伤实施定量分析的一种的检测方式。相关报告指出，TUNEL是一种可靠、有效的直接测量DNA 损伤方式，若能确定可靠参考值，该检测方式能够作为男性不育个性化、针对性治疗的预后测试方式[6]。

2 SDF 在ART 的临床意义

DFI 检测能够反映精子DNA 损伤程度，对预测ART 妊娠结局与自然妊娠具有一定的积极作用，同时可协助临床决策的制定[7]。孙园园、李森、陈南侨[8]等人研究显示，对486 对生殖中心体外受精一胚胎移植(IVF—ET)助孕初筛患者进行SDF 检测，依据DFI 分别三组，结果显示，DFI 升高可造成精子向前活动力下降，对精液质量产生影响，同时降低优质胚胎率等，影响妊娠结局。由此得出，对SDF 进行检测，可有效预测ART 妊娠结局。漆艳萍、彭洁、戚青林[9]等人研究SDF 率对ART 结局的影响，结果显示，SDF 率对ART 结局无明显性影响，但在一定程度上对受精结局可造成一定影响。

3 小结

SDF 检测方式较多，其中包括SCSA、SCGE、TUNEL 等，但仍缺乏统一明确参考值，造成SDF 检测在疾病评估、预测中仍存在一定争议。其中TUNEL 技术是检测SDF 最为直接的方式，其在未来具有更大的发展前景。SDF 在ART 中具有一定的临床应用价值，可直接反映精子DNA 损伤程度，同时在预测ART 妊娠结局中也有一定的积极作用，而在今后若能寻找一种检测SDF的无损伤方式，直接挑选DNA 完整的精子，以完成受精工作，将ART 的选择提供更多安全、有效保障。