NLRP3炎症小体在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展

梁仪琳，陈虹燚，黄照河

(1.右江民族医学院研究生学院，广西 百色533000； 2.右江民族医学院附属医院心血管内科，广西 百色533000)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是内科急危重症之一，目前我国AMI的发病率和病死率均呈不断上升趋势，给人们的身心健康造成严重威胁。打通罪犯血管、恢复心肌供血对于AMI患者非常重要，而早期、快速、有效的再灌注治疗(如静脉溶栓、经皮冠状动脉介入治疗、急诊冠状动脉旁路移植术)是救治AMI患者的关键。但血流再通、心肌重新恢复灌注后会出现心肌损害、心电功能障碍进行性加重的现象，这种现象被称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。MIRI严重影响AMI患者的转归，是造成AMI高病死率的危险因素之一，一直备受学者们的关注[1]。越来越多的研究表明，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体的表达水平与MIRI病情严重程度密切相关，NLRP3通过其亚单位胱天蛋白酶(caspase)1的活化，释放出强劲的炎症物质或开启一种可控、有序的“细胞自杀”新模式——细胞焦亡，而加剧炎症作用，导致MIRI心肌组织的进一步损伤[2-4]。作为炎症反应的核心，NLRP3是目前探索比较深入的炎症小体，且有可能成为治疗MIRI的一个重要靶点。现就NLRP3炎症小体在MIRI中的研究进展予以综述。

1 NLRP3炎症小体的组成及活化

1.1NLRP3炎症小体的组成 先天免疫系统作为机体抵抗外来或内在威胁的第一道屏障系统，能通过模式识别受体识别内源性或外源性危险信号等刺激并做出防御反应，而炎症小体是一种细胞内的模式识别受体，它通过细胞活化、释放细胞因子及炎症介质等引起炎症反应，在抵御感染、维护免疫稳态中占据重要地位。炎症小体大致可分为两类，即核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)蛋白家族和PYHIN(pyrin and HIN domain-containing)蛋白家族，其中被关注最多、最有特点的为NLRs家族中的NLRP3炎症小体，NLRP3炎症小体可识别许多不安全的信号，并在各种疾病条件下导致炎症反应，参与机体免疫。

NLRP3炎症小体的组装首先通过凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)在中间架起桥梁，然后由传感器NLRP3受体蛋白和效应器caspase-1前体蛋白组合形成[5]。NLRP3炎症小体是一种蛋白质复合物，亦是NLRs家族成员之一。大多数NLRs家族均存在一个同源的三域结构：①N端功能结构域(包括热蛋白结构域、caspase募集域和杆状病毒抑制重复序列域)，可以召集下游因子传送信号；②位于中间的核苷酸寡聚结构域，可识别配体；③C端亮氨酸重复区域[6]。NLRP3蛋白的特征为其N端热蛋白结构域可通过同型相互作用招募ASC，进而通过caspase募集域同型相互作用征集caspase-1前体，完成NLRP3炎症小体的组装，促使caspase-1的活化和白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-18的生成[7-8]。

1.2NLRP3炎症小体的活化 NLRP3炎症小体是人体免疫的重要调控者，它可以由各种激活剂触发，主要包括：①内源性损伤相关分子模式，如细胞损伤后释放的物质(ATP、高迁移率族蛋白B1、嘌呤代谢产物等)；②病原相关分子模式，如脂多糖、细菌、病毒等；③外源性刺激物，如强烈紫外线、铝等[9]。目前 NLRP3炎症小体的活化机制仍不明确，可能的机制包括：①线粒体活性氧类的产生；②ATP依赖的钾离子外流；③自噬与溶酶体渗漏[10]。

NLRP3炎症小体的活化分为两个过程。①启动：NLRP3炎症小体识别危险信号，并通过核因子κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)通路启动前体蛋白(包括NLRP3蛋白、前体IL-1β和前体IL-18)的表达；②触发：非活性的NLRP3、ASC和前体caspase-1相互结合，触发形成功能性NLRP3炎症小体，从而导致caspase-1前体蛋白裂解；此时处于活性状态的caspase-1对前体IL-1β和前体IL-18进行加工，使其转化为成熟、强效的促炎因子并分泌到胞外[11-12]。另外，活化的caspase-1可切割分解GSDMD(gasdermin D)，GSDMD释放出有打孔特性的N端结构域，N端结构域与磷脂结合在质膜上形成蜂窝状的孔洞，导致细胞破裂触发细胞焦亡，外溢的细胞内容物和IL加速了机体免疫防御反应，激活并放大炎症反应，从而导致细胞和组织损伤加重[13]。

2 NLRP3炎症小体与MIRI

2.1NLRP3炎症小体在MIRI中的激活 MIRI是AMI血管再通治疗过程中亟待解决的“瓶颈”问题，在国内外均备受关注。MIRI的机制比较复杂，主要与活性氧类大量生成、细胞内钙离子超负荷、细胞凋亡以及中性粒细胞等炎症细胞的浸润有关，其中炎症反应和炎症介质的释放伴随MIRI发生、发展的整个过程[14]。干预炎症反应的损伤性作用或下调炎症因子的表达，对降低MIRI心肌二次伤害的程度、改善心脏功能均具有重要意义。NLRP3炎症小体的活化及表达程度与MIRI疾病进展密切相关，但具体作用机制仍存在争议。有证据指出，在MIRI中细胞缺氧导致的活性氧类累积可刺激产生硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)，而TXNIP与NLRP3的亮氨酸重复区域结合，可启动和激发整个炎症小体[15]。Liu等[16]研究发现，沉默MIRI小鼠的TXNIP基因可以减少氧化应激、梗死面积和NLRP3的激活，表明在心肌微血管内皮细胞中TXNIP触发NLRP3炎症小体可能导致MIRI的发生。TXNIP是一种功能多样的蛋白质，通过抑制硫氧还蛋白系统的功能而发挥促进氧化应激、抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡等作用，在MIRI中TXNIP能够激活NLRP3炎症小体，NLRP3炎症小体活化可以进一步介导下游因子发挥作用，特别是caspase-1被激活后可发挥蛋白水解级联功能而逐步放大炎症反应，并诱导大量心肌细胞死亡，使再灌注的心肌损伤加重[17-18]。TXNIP在心肌微血管内皮细胞中的作用提示NLRP3炎症小体在不同细胞中可能具有不同的作用机制。

另外，心脏成纤维细胞在MIRI中也扮演重要角色。Kawaguchi等[19]研究表明，心脏成纤维细胞能够识别心肌细胞受损后释放的内源性生物介质，从而激活NLRP3炎症小体。此外，心肌组织缺氧损伤后释放的大量ATP可激活细胞膜表面的嘌呤受体P2X7，导致阳离子通道被打开，大量钙离子、钠离子内流，使细胞内钾离子水平降低，加速NLRP3炎症小体的活化[20]。有文献报道，串联孔区弱内向整流钾通道2(tandem of pore domains in a weak inward rectifying K+channel 2，TWIK2)蛋白可与P2X7受体合作完成NLRP3蛋白的组装和激发，最终导致心肌损伤[21]。这是探索NLRP3炎症小体在MIRI中激活机制的新成果，为寻找治疗MIRI的新靶点奠定了分子基础。

2.2NLRP3炎症小体在MIRI中的调节 炎症反应在MIRI发生、发展过程中扮演重要的角色。在心肌缺血再灌注过程中，多种分子在心肌细胞中表达，包括触发宿主炎症的模式识别受体，它能识别来源于损伤和坏死心肌的损伤相关分子模式，刺激机体免疫反应，而NLRP3炎症小体属于细胞内模式识别受体，NLRP3炎症小体及其下游信号ASC、caspase-1以及IL-1β、IL-18等在MIRI发病过程中起重要作用[22]。Kawaguchi等[19]利用ASC敲除小鼠和caspase-1敲除小鼠建立MIRI模型发现，除中性粒细胞和巨噬细胞外，心肌缺血处成纤维细胞中的ASC水平显著提高，与野生小鼠相比，敲除ASC和caspase-1小鼠炎症反应和损伤(包括心肌梗死的发展、心肌纤维化和结构损伤)均明显减少，提示ASC、caspase-1可能与再灌注损伤的致病机制有关。通过模拟小鼠MIRI实验发现，心肌NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表达均上调；进一步抑制NLRP3炎症小体可减轻病灶炎症及心肌坏死，且小鼠的心肌功能障碍和梗死面积也均显著改善[23-25]。上述动物实验结果说明了NLRP3炎症小体对MIRI的重要性，NLRP3炎症小体作为一种新型免疫标志物在MIRI的诊疗中具有一定的临床意义。在人体研究中也发现，NLRP3炎症小体诱发释放的下游炎症因子IL-1β和IL-18在经皮冠状动脉介入治疗后缺血再灌注损伤患者中高表达[26]，提示通过干预相关炎症损伤标志物，可以靶向NLRP3炎症小体，减轻心肌损伤。

细胞焦亡作为一种可诱发炎症反应并可调控的细胞死亡形式与MIRI疾病进展密切相关。Qiu等[27]通过糖尿病大鼠实验发现，NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡在MIRI中具有关键的致病作用，通过抑制NLRP3炎症小体能对抗心肌细胞焦亡，发挥减少心肌梗死面积和组织损伤、保护心脏的作用。郑亚萍和刘春杰[28]通过结扎大鼠冠状动脉造模实验发现，MIRI可显著升高NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β因子水平以及增加大鼠心肌梗死面积。由此可见，对这些因子以及心肌细胞焦亡进行调控可以很好地规避缺血和再灌注导致的心肌损伤。

另外，NLRP3还可独立于炎症小体发挥功能。Sandanger等[29]发现，与野生型和NLRP3敲除小鼠相比，ASC敲除小鼠MIRI转归并无显著改善，说明NLRP3和ASC在MIRI心肌损伤方面的作用存在差异。Shigeoka等[30]在肾缺血再灌注损伤小鼠模型实验中发现，NLRP3缺失小鼠的肾小管损伤和肾功能均显著好转，而ASC或caspase-1基因缺失小鼠的肾损伤无显著改善。Inoue等[31]也发现，敲除NLRP3基因小鼠的肝缺血再灌注损伤显著改善，而ASC基因缺失小鼠的肝脏损伤未见明显改善。此外，有学者通过动物研究、细胞培养等实验强调了NLRP3在非专业免疫细胞中的独特作用，NLRP3可独立于炎症小体调节炎症的不同方面，在心脏成纤维细胞分化和心肌纤维化发展中发挥重要作用[32]。这些研究揭示了NLRP3与ASC、caspase-1可不依赖于组装形成的炎症小体而单独发挥作用，在各种类型细胞或组织中介导炎症反应，推动疾病进程。

炎症是机体防御的一种保护性反应，对组织修复以及防止致病因子持续攻击均很重要，炎症反应不足或过表达均会对机体产生不利影响。NLRP3炎症小体在MIRI中具有保护作用还是致病作用目前仍存在争议。有学者发现，在开胸和闭胸MIRI模型中NLRP3炎症小体的表达完全不同，在开胸造模小鼠的心脏中可检测到NLRP3蛋白，而在闭胸实验中未检测到NLRP3蛋白，表明闭胸造模可能减轻MIRI的炎症反应，NLRP3炎症小体的表达可能与开胸手术创伤应激相关，而与急性MIRI无关[33]。Sandanger等[34]结扎NLRP3基因敲除小鼠的左冠状动脉后进行再灌注发现，NLRP3缺陷小鼠的心肌梗死面积较野生型小鼠大，表明在MIRI中NLRP3炎症小体可能发挥积极的保护作用。

3 以NLRP3炎症小体为靶点治疗MIRI

NLRP3炎症小体是MIRI后初始炎症反应的关键分子机制之一，可诱导释放的炎症物质持续作用于缺血心肌，加速心肌结构损伤和功能障碍，因此以NLRP3炎症小体为靶点治疗MIRI可能是一个新途径。MCC950、CY-09、OLT1177等在动物实验中均被证明是有效的选择性NLRP3抑制剂，可通过靶向抑制NLRP3炎症小体的活化而发挥潜在的疾病防治作用，但这些均只停留在实验尚未正式应用于临床[24,35-36]。另外，P2X7受体可通过诱发NLRP3炎症小体的活化参与MIRI，Granado等[37]给予MIRI大鼠P2X7受体拮抗剂后，其心肌中的抗凋亡标志物表达上调，心脏功能及能量代谢均显著改善。可见，P2X7受体具有成为干预MIRI新靶标的潜能。秋水仙碱是最古老的抗炎药之一，可通过抑制NLRP3活化，防止P2X7受体诱导的孔洞形成，限制钾离子流出，从而发挥抗炎作用[38]；在大鼠MIRI模型实验中发现，秋水仙碱处理组心肌梗死的进展及心肌纤维化等均显著改善[39]。Marchetti等[40]发现，格列本脲合成途径中的中间产物16673-34-0可通过降低NLRP3炎症小体的表达水平限制小鼠MIRI后的梗死面积，因其不含与胰岛素释放有关的环己脲基团而对血糖无影响，因此小分子16673-34-0可能作为一种有拮抗NLRP3炎症小体作用的新型药物应用于MIRI的临床防治中。NLRP3炎症小体是MIRI发生、发展的重要驱动因子，靶向抑制NLRP3炎症小体可能是减少MIRI心肌损伤的全新方法。NLRP3炎症小体抑制剂的研发前景广阔，但仍需进一步的临床试验评估其疗效和安全性。

NLRP3炎症小体的效应因子IL-1β和IL-18活化后即可触发其他炎症介质的释放，扩大炎症反应，直接参与心肌组织的进行性破坏。Toldo等[41]研究证实，重组人IL-1受体阻滞剂阿那白滞素可有效减小小鼠MIRI的梗死面积，改善心肌重构；在治疗合并冠心病的类风湿关节炎患者的临床试验中发现，阿那白滞素亦具有改善冠状动脉及左心室功能的作用[42]。靶向IL-1β的人单克隆抗体卡纳单抗可阻断炎症通路，抵抗心肌细胞炎症坏死。2017欧洲心脏病学学会年会上公布了卡纳单抗最新Ⅲ期大型临床试验——卡纳单抗抗炎性血栓转归的研究结果，该结果显示，卡纳单抗靶向作用于IL-1β/IL-6通路可显著降低炎症性心血管不良事件发生的风险[43-44]。在大鼠MIRI模型的研究中也发现，降低循环中的IL-18水平同样可延缓炎症和损伤进展，提升心脏功能[45]。可见，IL-1、IL-18是MIRI心肌损伤重要的介导因素，拮抗IL-1和IL-18受体、干预上游重要激活物NLRP3炎症小体的功能对MIRI有保护效应，是防治MIRI靶向药物研发的新方向，值得进一步探究。

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)也参与了MIRI的病理过程。lncRNA可通过调节相关微RNA(microRNA，miRNA)的表达，调控NLRP3炎症小体和心肌细胞焦亡，有可能成为MIRI临床诊断标志物及分子类药物靶点。研究发现，lncRNA-肺腺癌转移相关转录子1在MIRI中高表达，可通过“海绵吸附效应”降低miR-133水平，促进缺血再灌注心肌中NLRP3炎症小体的表达，加重炎症反应和再灌注心肌损伤[46]。Zhao等[47]研究发现，下调lncRNA-肺腺癌转移相关转录子1、上调miR-145可减少MIRI模型小鼠心肌损伤和细胞凋亡，发挥心脏保护作用。miRNA是NLRP3炎症小体重要的调节剂，亦是MIRI重要的调控因子之一。在MIRI动物模型实验中发现，miR-223、miR-495、miR-135b等可以靶向下调NLRP3及其下游因子的表达水平，抑制缺血再灌注诱导的心肌细胞毒性和细胞焦亡，改善炎症反应，恢复受损的心脏功能[48-50]。目前对lncRNA的认识还较肤浅，相信随着科技的发展，未来能够发掘更多特异性调控NLRP3炎症小体和细胞焦亡的lncRNA，并成功地应用于MIRI的临床诊治中。

此外，许多中草药活性成分在防治MIRI方面也具有重要作用，具有潜在的临床应用价值。中草药成分木樨草素、灯盏花乙素、甲氧基异黄酮等已被证明可针对性地干预NLRP3炎症小体的活化，具有对抗MIRI的效用[4,18,51]。临床上，常用于治疗心脑血管疾病的中成药脑心通也被证明在MIRI模型中可通过抑制NLRP3炎症小体的活化发挥心脏保护作用[52]。近年研究还发现，白芍总苷、大黄素、天麻素等均可有效改善MIRI心肌损伤，减小梗死面积，其作用机制可能与负向调节NLRP3炎症小体触发的心肌细胞焦亡有关[28,53-54]。传统中医药具有多成分、多靶点、多通路的优势，在心血管疾病(包括MIRI)临床治疗方面具有良好的疗效。但由于中药发挥作用的具体机制及不良反应目前尚不明确，其在临床应用中仍存在局限。相信未来通过对中草药分子、基因水平作用机制的深入探索以及循证科学证据的积累，可为中医药在MIRI防治中发挥重要医学价值奠定基础。

4 小 结

NLRP3炎症小体的活化效应对MIRI发生、发展过程具有重要影响，阻断NLRP3炎症小体相关信号通路可有效发挥心肌保护作用，是研发防治MIRI新药的一个重要分子机制。目前，靶向干预NLRP3炎症小体及其下游分子治疗MIRI的药物研究层出不穷，其中中草药的潜在价值凸显，但仅限于基础研究，尚未在临床推广应用。NLRP3炎症小体在MIRI中具体的激活和调控机制目前尚未明确，因此，未来如果能在NLRP3炎症小体的科研工作上取得重大进展，将有助于进一步明确NLRP3炎症小体在MIRI中的作用及分子机制，为MIRI乃至其他心血管疾病的临床防治提供新思路，同时也为研发新一代药物提供新靶点。