长链非编码RNA在结核病发病过程中的作用

林剑文，王辉，师志云，施建党，杨宗强，牛宁奎

(1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.宁夏医科大学总医院脊柱骨科，银川 750004)

结核病主要由胞内致病菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起，可累及全身各器官组织，随着病情进展临床表现为消瘦、乏力、盗汗、瘫痪、大小便失禁等症状[1]。结核病是威胁人类健康的主要疾病之一，更是传染病导致死亡的首要原因[2]。国内外对结核病的发生、发展进行了大量研究，发现不同人群感染MTB后可诱发体液免疫和细胞免疫，宿主感染MTB后的转归受宿主免疫功能状态影响，当宿主免疫功能状态良好时，MTB能以休眠状态在宿主体内长期生存，当宿主免疫力降低时，MTB将转入增殖期[3]，在宿主各器官组织形成病灶，导致结核病的发生。结核病是受多种基因调控、由多条信号通路参与并相互作用形成的炎症性疾病，其发病机制十分复杂[4-5]。许多与结核病发病相关的蛋白质及信号通路的功能目前仍未明确，部分蛋白质及信号通路在结核病发病的不同时间、不同部位可能表现出相反的功能。而炎症反应的发生与基因转录、翻译水平以及蛋白质-蛋白质相互作用的动态变化密切相关，其中长链非编码RNA (long noncoding RNA，lncRNA)能够在转录及转录后水平上调节蛋白编码基因的表达，广泛参与包括细胞分化及个体发育在内的重要生命过程[6]，且异常表达的lncRNA常提示疾病的发生、发展。目前，已在肿瘤、炎症等多个领域展开了针对lncRNA的研究，并取得了一定进展[7-10]。现就lncRNA在结核病发病过程中的作用予以综述。

1 lncRNA概况

1.1lncRNA的性质 在人类基因组共30亿个碱基对中，约有75%可转录为RNA，其中近74%的RNA为非编码RNA[11]。非编码RNA不仅包括核糖体RNA、转运RNA、核小RNA、小核仁RNA、微RNA(microRNA，miRNA)等多种已知功能的RNA，还包括未知功能的RNA，如lncRNA、环状RNA等，其中，lncRNA是长度超过200个核苷酸的非编码RNA，在真核细胞内普遍转录，位于细胞核或细胞质内，但不具有编码蛋白的功能[12]。根据位置不同lncRNA又可分为反义长链非编码RNA、内含子非编码RNA、基因区间lncRNA等不同类型[13]。与小核仁RNA、miRNA相比，lncRNA的序列保守性较低，但这并不影响其在功能上的保守性[14]。

1.2lncRNA的功能及作用途径 lncRNA主要定位于细胞核，转录水平低于蛋白质编码基因，相对于信使RNA，lncRNA在通常情况下会显示出更强的细胞或组织特异性，细胞可以lncRNA为地址，招募或隔离已存在的蛋白质，调整特定区域的生理活动，参与表观遗传、可变剪接、入核转运等过程，也可通过细胞微结构原件、miRNA前体等发挥功能，lncRNA转录和功能失调可导致相关生理活动异常，参与肿瘤、炎症的发生[15]。lncRNA发挥功能的机制多样，既可作为miRNA的前体存在，也可通过RNA-DNA、RNA-RNA或RNA-蛋白质等多种作用方式发挥调控功能，调节机体生理、病理活动[6,16-17]。

2 lncRNA在结核病发病中的作用

既往研究表明，MTB感染可诱发宿主体液免疫和细胞免疫，这一过程涉及多种不同免疫细胞和细胞因子[18]。MTB在宿主体内多个相互影响的信号通路调控下，引发一系列生理及病理性炎症反应，导致结核病的发生[5]。

2.1通过表观遗传的改变调节细胞因子和蛋白质的表达 表观遗传指在基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达水平发生变化，包括DNA甲基化、基因沉默以及RNA编辑等。研究发现，lncRNA的表达水平可能会影响邻近蛋白编码基因的表达，调节蛋白质的表达水平[19-20]。Wang等[21]研究发现，在活动性结核病患者的CD8+T细胞中，lncRNA-CD244的表达升高，lncRNA-CD244通过介导infg/tnfa位点H3K27的三甲基化向抑制染色质状态发展，抑制CD8+T细胞中γ干扰素、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表达，抑制宿主对MTB的清除，导致结核病发病；为进一步证明上述机制，研究者敲除了小鼠的lncRNA-CD244基因，发现该小鼠在感染MTB后γ干扰素、TNF-α的表达均较对照组增加，同时对MTB的清除能力增强，感染程度降低，lncRNA-CD244可通过调节γ干扰素、TNF-α的表达参与结核病的发病过程，证明了lncRNA的表达水平可对邻近的蛋白编码基因的表达产生影响。此外，对结核病患者及健康人群进行lncRNA芯片检测发现，多数lncRNA在表达水平出现差异的同时也常伴有邻近信使RNA表达水平的改变，通过后续逆转录-聚合酶链反应试验发现，结核病患者与健康人群lncRNA及信使RNA表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)[22]。目前，部分蛋白质在结核病发病过程中的作用研究已取得了一定进展。LINC00229作为增强子样lncRNA，可增加其邻近信使RNA Rho GTP酶激活蛋白8(Rho GTPase activating protein 8，ARHGAP8)的表达，进而调节细胞骨架组织、细胞周期进程和细胞迁移功能[23]，通过促进MTB进入宿主细胞参与结核病的发病过程[24]。基因区间lncRNA XLOC_009016可抑制信使RNA酸性海藻糖酶样蛋白1(acid trehalase-like protein 1，ATHL1)，降低Ⅳ型胶原纤维的降解，在MTB感染后，基因区间lncRNA XLOC_009016表达降低导致的信使RNA ATHL1表达水平升高可能与结核病导致的机体组织破坏有关[25]。活动性结核病患者lncRNA XLOC_012582高表达可导致细胞因子信号转导抑制因子3高表达[26]，进而导致结核病的进展[27]。细胞因子信号转导抑制因子3既可促进人T细胞转变为产生白细胞介素-17的辅助性T细胞，降低CD4+T细胞的体外增殖，导致T细胞耗竭[28]，也可抑制信号转导及转录激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)3的激活，STAT3在阻断吞噬酶体成熟、诱导巨噬细胞自噬和凋亡、降低巨噬细胞免疫保护作用的同时，还可增强T细胞免疫保护作用，并参与记忆细胞的分化[29]。

多数在结核病患者及健康人群中呈差异表达的蛋白质在结核病发病过程中的作用目前尚未明确。例如，增强子样lncRNA Rp4-781K5.4可增加信使RNA 1号染色体开放阅读框31(chromosome 1 open reading frame 31，C1orf31)的表达，C1orf31是一种线粒体复合体Ⅳ组装因子，对环加氧酶2的生物发生至关重要，可刺激CD4+T细胞转化为调节性T细胞，调节机体的免疫耐受功能[30]，但C1orf31与结核病的发病过程是否有关仍需要进一步研究；而基因区间lncRNA XLOC_007896可抑制信使RNA序列相似家族69成员B的表达，序列相似家族69成员B可能作为钙依赖的激酶发挥作用，并参与蛋白质的磷酸化，进而参与机体生理活动[31]。尽管lncRNA无法编码蛋白质，但可通过表观遗传的改变调节不同基因的表达水平，影响相关蛋白质的表达，从而广泛地参与调节机体包括细胞分化及个体发育在内的重要生命过程。

综上所述，lncRNA虽无法编码蛋白质，但在基因表达过程中通过对表观遗传的调节发挥重要作用。结核病患者体内异常表达的lncRNA可通过表观遗传的改变调节相关细胞因子及蛋白质的表达，进而影响各信号通路功能，导致机体免疫功能改变，借此参与MTB抵抗宿主免疫系统清除、休眠于巨噬细胞及转入增殖期的生物学行为以及炎症的发生、机体组织的破坏，在结核病的发生、发展中发挥重要作用。

2.2通过信号通路参与调节机体免疫功能 结核病发病是受多基因调控、多条信号通路参与的复杂的炎症反应过程。参与结核病发病的信号通路主要包括转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)通路[32]、TNF-α通路[33]、Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)/促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路[4,34-35]、Janus激酶(Janus kinase，JAK)-STAT信号通路[36]以及NF-κB受体活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB，RANK)/NF-κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)信号通路[37]等，这些通路均在结核病的发病过程中发挥了重要作用。

2.2.1TGF-β信号通路 既往研究表明，MTB可导致活性TGF-β产生，作为抗炎细胞因子，TGF-β可通过TGF-β/Smads经典通路抑制γ干扰素和TNF-α的活性，阻断γ干扰素与TNF-α可抑制MTB在细胞内复制的能力，促进MTB在巨噬细胞内的持续存在和生长[38-39]；TGF-β还可抑制T淋巴细胞的功能，诱导巨噬细胞凋亡，降低机体对MTB的抵抗力[40-41]。有研究发现，非致病性分枝杆菌(如污垢分枝杆菌)感染巨噬细胞后可导致lncRNA人母系表达基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)上调，lncRNA MEG3通过形成RNA-DNA三链结构下调TGF-β表达，增强机体对MTB的清除能力[42]。此外，TGF-β还可通过TGF-β/Smads通路及蛋白激酶途径诱导TGF-β2基因位点相反链转录TGF-β2-反义RNA(antisense RNA 1，AS1)，TGF-β2-AS1属于lncRNA，可抑制TGF-β的表达，进而抑制TGF-β/Smads信号通路[43-44]。这说明TGF-β/Smads信号通路可能通过调控部分lncRNA对TGF-β/Smads信号通路的信号输出进行负反馈调节[44]。

2.2.2TNF-α信号通路 TNF-α通路在机体清除MTB过程中发挥重要作用。在活动性结核病患者体内，CD8+T细胞中高表达的lncRNA-CD244可抑制TNF-α的生成，抑制TNF-α信号通路对MTB的清除作用，导致结核病的发生、发展[21]。TNF-α也可抑制机体对MTB的清除，脊柱结核患者病灶中上调的lncRNA 小核仁RNA宿主基因15通过增加RANK和RANKL基因及蛋白的表达调节RANK/RANKL途径，使白细胞介素-6和TNF-α分泌增加，增加破骨细胞的形成和增殖[37]，而MTB可减少破骨细胞凋亡，抑制坏死，降低破骨细胞对刺激反应的敏感性，从而促进破骨细胞内潜伏的MTB逃逸，对抗免疫细胞的杀菌作用[45-46]。此外，TNF-α还可诱导巨噬细胞凋亡，抑制巨噬细胞清除细胞内分枝杆菌的自噬作用，该过程受lncRNA-PC酯酶结构域1B(PC-esterase domain containing 1B，PCED1B)-AS1调节，在MTB感染后，lncRNA-PCED1B-AS1下调，减少lncRNA-PCED1B-AS1与巨噬细胞miR-155的结合，抑制TNF-α诱导的巨噬细胞凋亡，促进巨噬细胞自噬，消除细胞内的分枝杆菌[47]。

2.2.3其他信号通路 除TGF-β信号通路和TNF-α信号通路外，lncRNA还可通过其他信号通路参与结核病的发病过程。例如，lncRNA XLOC_012582高表达可导致细胞因子信号转导抑制因子3高表达，通过抑制STAT3的表达抑制JAK-STAT信号通路的功能，导致严重的免疫功能紊乱，促进结核病的进展[29]。lncRNA-MEG3参与调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路，lncRNA-MEG3的减少可以诱导巨噬细胞通过自噬消除巨噬细胞中的分枝杆菌[48]。在MTB感染过程中，lncRNA-核富集转录本1的表达增加，lncRNA-核富集转录本1可通过c-Jun氨基端激酶/胞外信号调节激酶通路影响巨噬细胞中细胞因子的表达，上调TNF-α和白细胞介素-6的表达，增强巨噬细胞对胞内MTB的清除[49]。lncRNA-ROCKI(regulator of cytokines and inflammation)是由TLR信号通路诱导产生的炎症反应调节因子，可与脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1结合，减少ROCKI转录以及随后的钙离子信号和炎症基因的表达，以负反馈方式抑制细胞因子的产生[50]。lncRNA-AC145676.2.1-6能与45个miRNA相互作用，在感染MTB后miR-29a显著上调，并抑制涉及细胞因子-细胞因子受体相互作用及TLR信号通路的主要靶基因的表达[51]。同时，巨噬细胞与Marcks效应域肽的孵育不仅可以阻止Marcks的磷酸化及其与膜的解离，还可抑制脂多糖诱导的p38、c-Jun氨基端激酶及NF-κB的激活，进而抑制炎症细胞因子的产生[52]。

综上所述，机体感染MTB后出现差异表达的lncRNA可通过调节细胞因子及蛋白质的表达，参与多种不同信号通路的信号传递过程，引起巨噬细胞、T细胞、B细胞、破骨细胞等功能改变，调节机体免疫细胞的功能，降低宿主对MTB的清除能力，导致结核病的发生、发展[53-54]。

2.3作为诊断标志物 结核病患者与健康人群中部分lncRNA表达存在显著差异，在这些lncRNA中有部分lncRNA相关联的信使RNA目前尚未明确，因此无法判断这部分lncRNA在结核病发病过程中的作用。例如，lncRNA-HNF1B-3：1[55]、lncRNA-tgs1-1[56]、MIR3945HG V1和MIR3945HG V2[22]、ENST00000-360485[22]、ENST00000354432和ENST00000427151[57]以及lncRNA-AC079767.4[58]等相关联的信使RNA目前尚未明确，但这些lncRNA在结核病患者与正常人群中的表达存在显著差异，因此可作为结核病潜在的诊断标志物，用于结核病的早期诊断及治疗。此外，还可通过基因敲除或基因沉默，探索lncRNA相关联的信使RNA或表观遗传途径，作为结核病发病机制的进一步研究方向。

3 小 结

lncRNA虽然无法编码蛋白质，但可通过对表观遗传的调节参与调控细胞因子及蛋白质的表达，调节机体免疫功能，并参与结核病的发病过程。目前，针对lncRNA在结核病发病过程中作用的研究已经取得了部分成果，但仍未阐明MTB抵抗宿主免疫系统清除、休眠于巨噬细胞及转入增殖期的生物学行为以及MTB介导的对组织破坏行为的分子生物学机制。lncRNA的表达异常与结核病的发病过程密切相关，且部分lncRNA在机体早期感染MTB后即可在血液中出现差异表达，因此lncRNA可作为结核病的早期诊断指标。对差异表达lncRNA功能的研究是深入探索机体感染MTB后结核病发生、发展机制的有效方法，未来仍需进一步深入研究lncRNA在结核病发病过程中的作用。