口岸动物疫病ELISA 检测的影响因素分析及优化方法探析

林萍萍 黄骅港海关 河北渤海新区黄骅港（河北，黄骅，061600）

近年来，随着我国畜牧业的快速发展，改良品种、优化牛类种群遗传性能的需求日益增加，境外引种就成了重要途径，其促进我国养殖业和经济贸易发展的同时，也增加了疫病传入的风险［1-2］。 加强进境种牛检验检疫和监管已成口岸动物检疫面临的重要课题， 实验室疫病检疫发挥着重要的作用。酶联免疫 （Enzyme-linked immunosorbnet assay，ELISA） 是把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机结合起来的一种检测技术，原理是抗原或抗体吸附于固相载体进行免疫酶反应，经底物显色后用酶标仪进行检测，由于待测谱物的含量与呈色物质的颜色具有相关性，因此可以通过颜色的不同来达到定性定量分析待测样品的目的。 由于ELISA 方法具有操作简单、 灵敏度高和特异性高等特点，并且适合批量样品检测，因此广泛应用于口岸进境种牛疫病检测［3-6］。但实验室在实验操作过程中因诸多因素影响检测结果的准确性，即会出现一些假阳性或假阴性，因此，有必要深入分析其影响因素，并优化方法、规范实验操作，确保实验结果准确有效，把好国门生物安全，也为动物疫病检测工作的开展提供依据。 本文就种牛疫病ELISA 检测的影响因素从“人、机、料、法、环”等多个方面进行分析。

1 人的因素

实验室专业技术人员是开展动物疫病检测的中心人员， 是影响实验结果准确性的重要因素，因此要求从事相关工作的实验室人员要求必须具备较强的专业知识和熟练的操作技能。 在种牛疫病ELISA 检测实验中， 血清样品处理、 移液器使用不当、酶标洗板的彻底程度等都会对结果造成直接的影响。 为此，应对实验人员定期组织开展业务培训考核、能力验证和人员比对等，持续保证实验人员熟悉实验操作流程和仪器设备的操作能力，以便保质保量地完成动物疫病检测工作。

2 机的因素

仪器设备的准确度是进行实验检测最基本的要求，是影响检测结果的直接因素之一。 不同厂家仪器设备存在检测性能的差异，如洗板机，进口的性能要高于国产，在洗板时洗出的彻底。 为了确保检测结果真实有效，实验室应定期对检测仪器进行计量检定、维护，使用前进行校准，确保仪器可以正常运行。

3 料的因素

3.1 样品因素

待检样品的质量是确保实验结果准确性的重要因素，因此样品要求新鲜和纯净。种牛疫病ELISA实验一般采用种牛血清进行检测。

3.1.1 样品采集及送检

在采集样品时，应使用无菌采集针管，尽量避免反复颠倒，严防样品溶血的产生，因样品的溶血血红蛋白中含有类过氧化物酶活性的亚铁血红素，在以辣根过氧化物酶（HRP）为标记的ELISA 实验中，会增加非特异性显色造成假阳性结果的产生［7］，因此，应尽量避免溶血，对于严重溶血样品需重新采样。 工作人员需要对采集的样本进行检查，包括样品质量、数量、标识、记录等，避免出现样品采集错误。及时将样品送往实验室检测，血清样品放置时间过长， 易受细菌污染， 而细菌体内可能有内源性HRP，出现非特异性显色，造成假阳性结果的出现。

3.1.2 样品处理

分离血清需要注意几点问题：分离血清时核对好样品编号，样品一式两份，一份待检样品，一份留样保存，血清可冷藏自然析出，也可离心析出，但需控制离心的速度和时间，过度离心会造成红细胞破裂，影响实验结果。

3.1.3 样品保存

如不能及时检测， 应将样品冷藏或冷冻保存，尽量避免反复冻融，反复冻融会破坏样品中的蛋白分子如抗体，造成假阴性结果的出现。 一般来说，一周之内进行检测，将样品存放在2-8 ℃即可，如因特殊原因需延时检测， 可将样品及时分装后放置于-20 ℃或-80 ℃冷冻保存。

3.2 试剂因素

3.2.1 试剂盒的选择

选择合适的试剂盒是保证实验结果的关键因素。 目前口岸种牛疫病检测常用进口试剂盒如IDVET、BIOVET、kernel 等，实验结果表明不同厂家的试剂盒由于采用的方法（竞争ELISA、阻断ELISA、夹心ELISA 等）不同，检测结果存在差异性。 因此选购试剂盒时，需全面了解其技术参数、性能指标，使用时注意试剂盒的有效期及保存温度，如果保存不当或使用过期试剂盒均会影响实验结果。另外，同一厂家试剂盒不同批次之间不能混用， 因其制作过程很难保证质量完全一致，容易造成结果差异现象。

3.2.2 试剂盒的回温

在实验过程中对试剂的准备考虑不周，经常会出现试剂盒从冰箱刚拿出来就开始实验，会出现阳性对照、洗涤液等试剂没有化开的现象，从而影响实验反应时间，其直接后果会导致对一些弱阳性样品的检测出现假阴性。 因此在ELISA 实验开始前，最为关键的是将试剂盒提前从冰箱里拿出来，按说明书要求在室温放置30 min 至与室温平衡，并避免阳光直射，其目的是使微孔内的温度能较快地达到后面测定的需求温度。

4 法的因素

检测方法、标准规范和质量控制程序及其相关计划是也是影响实验结果的直接因素之一。 检测方法严格按照标准和相关技术规范进行选择，种牛疫病ELISA 检测时应遵循标准选择相适宜的试剂盒，并定期对检测流程和标准进行修订，避免在检测过程中使用已作废的方法，从而影响实验结果的准确性。 实验室的质量控制及其相关计划是监控检测过程最有效的手段，按计划进行实验人员比对、留样再测、测量审核等质量控制，确保检测数据的准确性，在此过程中如出现异常，及时找出原因，并提出改进的相关措施。 适宜的检测方法和标准能够为实验人员提供较好的理论基础和技术指导。

5 环的因素

实验室的环境是影响实验结果的先决条件，即检测过程所在的环境温度、湿度及纯洁度等，必须满足国家相关的法律法规、技术规范或标准的要求［8］。室温对ELISA 实验结果有影响，室温偏低会对样品和试剂产生影响，导致反应速度慢，进而影响实验结果。 实验过程中所用的物品及周边环境受到污染，也会对实验结果产生影响。 对此，应每周对实验室的温湿度等相关记录进行查巡并实时记录，定期对实验室进行清洁消毒，保证实验室环境满足实验要求，消除其对实验室结果带来的影响。

6 实验关键环节的因素

6.1 加样

加样是影响ELISA 结果的最常见的因素，样品稀释，严格按照不同试剂盒对样品稀释倍数的规定进行操作，其目的是减少非特异性反应，所以在检测过程中一定是先加稀释液再加样品。 需要引起注意的是加样后要在微量振荡器上震荡混匀30 s，防止溢出。

在种牛疫病ELISA 初筛实验中，由于检测量比较大，一般采用多通道微量移液器，使用多通道微量移液器需要注意几点：正确使用，使用前调整移液器的加样量；加样速度不可过快，否则无法保证微量加样的准确度和均一性；避免将样品加到反应孔壁上，因为孔壁上部是非包被区，易导致非特异性吸附，造成假阳性结果的出现；避免产生气泡和溅出，气泡会引起反应界面差异，溅出会造成相邻孔污染；避免枪头碰触到孔底部，并保持孔外底部洁净，有利于酶标仪检测。 移液器长时间使用会出现磨损， 或内部附着血痂等原因造成加样不准确，因此有必要定期对移液器进行维护和计量校准。 此外，样品较多时应分批检测，避免加样后温育前等待时间超时。

6.2 温育

温育是ELISA 检测中最关键、也是最容易出现问题的环节。 ELISA 实验中抗原抗体反应必须保证一定时间的温育，且温育所需要的时间一般与温度成反比。 种牛疫病检测中最常用的温度是37℃和室温，温度过高或温育时间不够，易造成弱阳性样品漏检情况。 因此，在日常检测过程中，要严格按试剂盒说明书控制温育的时间和温度，不能人为延长或缩短温育时间，应根据不同的室温条件及时调整温箱的温度， 在温箱放置温湿度计来测量观察即可。温育时，需在酶标板表面贴粘膜，防止孔内液体蒸发或水珠等异物掉入孔内引起污染。 切记封板膜不能重复使用，以免引起交叉污染。

6.3 洗板

洗板是ELISA 实验中操作次数最多的重要环节，应引起实验人员的重视。 洗板次数减少、洗板不彻底造成残留，可能引起假阳性结果的产生；洗板次数过多，可能会洗脱掉抗原抗体结合物，引起假阴性结果。 无论是手工洗板还是洗板机洗板，要严格按照试剂盒说明书规定的洗涤次数、 洗涤体积、洗涤时间进行操作，不能人为改变洗板要求。 在洗板的过程中，尽量保证操作标准，如避免洗板液过多溢出孔外，甩板要快速干净，使用干净的滤纸不在同一地方重复拍板等，操作的准确与否直接影响检测结果的重复性和准确性。

7 结语

口岸进境动物检验检疫的核心任务就是防止危险性疫病疫情传入国内，控制动物疫病跨境传播和扩散［9］，保障我国养殖业生产安全、动物生命和人民的身体健康，因此做好口岸动物疫病检验检疫工作尤为重要。ELISA 自建立以来，由于其自身的优势被广泛应用于海关、兽医实验室、科研单位等，但实验过程中有诸多因素影响检测结果的准确性，应对其原因进行深入分析，并及时进行整改。 首先要保证实验室环境设施和仪器设备处于良好状态；其次，实验涉及的试剂及检测方法必须标准化，及时更新检测标准和技术规范； 另外实验技术人员需定期培训，加强业务学习，提高专业技能，严格按照实验室规章要求进行样品的检测，在一次又一次的实践中对这些关键环节进行探索和优化，认真避免或减少影响因素， 尽量避免假阳性和假阴性结果的出现，提升口岸动物疫病的检验检疫技术水平，确保数据准确可靠，从而保障国内养殖业健康和可持续发展。