放射性肺损伤机制及干细胞治疗研究进展

牛世英 杨彤 张月英

山东第一医科大学基础医学院，济南 250062

放射性肺损伤(radiation-induced lung injury，RILI)是对胸部的恶性肿瘤进行放射治疗引起的并发症，最多见于对肺癌、乳腺癌的放疗。在放疗过程中可使病变周围的肺组织因接受到超过其阈值的放射剂量导致产生不可逆性的损伤。RILI的轻重随着放射剂量、放射部位和放射的范围不同而有差异。大面积、高剂量的放疗，RILI的发生率和严重程度大。RILI的病理变化包括两个阶段：早期的放射性肺炎和后期的放射性肺纤维化。虽然放疗技术的有所发展，但接受胸部放射治疗的患者仍有30%会发生RILI。RILI的发生涉及多种因素，现普遍认为是射线导致Ⅱ型肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤产生的多细胞因子级联的结果，从而引起炎症和纤维化。

1 RILI的机制

1.1 细胞损伤 当肺暴露于射线时，首先出现的反应就是细胞损伤，包括内皮细胞和上皮细胞。上皮细胞和内皮细胞损伤时，其完整性被破坏，随后会有一系列细胞因子被释放，以至于大量内容物和炎性细胞集聚于肺泡腔，从而引起炎症反应。炎症反应的长期不断刺激导致纤维化的发生。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在生物体进化、内环境的稳定以及系统发育中起着重要作用。同时，细胞凋亡也存在于病理情况下。有研究表明，射线引起RILI的过程中，细胞凋亡起着重要作用。以下是射线引起的几种细胞的凋亡。

1.1.1 血管内皮细胞 血管内皮细胞位于血管内壁的单层扁平上皮，构成了血管组织间屏障的重要成分，在血管生成、收缩与舒张中起着重要的作用。有研究发现，血管内皮细胞是辐射敏感细胞，照射剂量一旦超过其阈值，血管内皮细胞便会发生损伤，最主要的结果就是凋亡反应，之后便会引起细胞因子瀑布反应，导致炎性细胞和内容物渗出，激发炎症反应；同时，炎性细胞和内容物的不断刺激导致纤维化形成[1]。并且射线导致血管内皮细胞损伤，屏障功能受到破坏，血管通透性增强，大量的炎症因子从受损细胞中释放，从而引起炎症反应[2]。此外，当肺部接受射线照射后，会引起氧自由基的产生[5]，诱导血管内皮细胞的凋亡。因此血管内皮细胞凋亡在细胞损伤中起着重要作用。

1.1.2 肺泡上皮细胞 射线照射后，肺泡上皮细胞发生损伤，主要是Ⅱ型肺泡上皮细胞发生凋亡，从而导致肺泡塌陷，促进纤维化的发展。其次，研究发现，射线照射后，肺实质细胞中促凋亡基因Bax表达增加，凋亡抑制因子Bcl-2表达减少；同时间质细胞凋亡抑制因子Bcl-2表达增加，表明促凋亡基因和凋亡抑制基因的不平衡表达在肺纤维化过程中可能起重要的作用[3]。研究还发现，肺泡上皮细胞数量的减少导致成纤维细胞过度增生，从而发生纤维化；而且Ⅱ型肺泡上皮细胞的凋亡也会影响Ⅰ型肺泡上皮细胞[4-6]。此外，最近的研究表明，肺泡上皮细胞可以通过上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的过程转化为肌成纤维细胞，并且肺泡上皮细胞发生EMT已在人类特发性肺纤维化和实验性肺纤维化中得到证实[7-8]。

1.2 肺泡巨噬细胞聚集 肺部接受射线照射可引起肺泡上皮细胞和内皮细胞损伤，从而导致的大量炎症因子释放，招募炎细胞聚集在损伤部位，进一步扩大炎症反应。同时，接受射线照射的肺泡巨噬细胞会引起活性氧的产生，促进巨噬细胞向M1表型转化，引起炎症反应[9-10]。其次巨噬细胞也可通过释放转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)导致成纤维细胞的激活，最终诱发肺纤维化[5]。

1.3 细胞因子释放 细胞因子在RILI发生中倍受关注，受损细胞会释放细胞因子和趋化因子，促进炎性细胞迁移到受损部位，募集在受损部位的炎性细胞会分泌许多细胞因子，如IL-6、肿瘤坏死因子α、TGF-β1和IL-1α等。这些细胞因子在放射性肺炎和纤维化的发展中发挥关键作用[11]。

TGF-β1是与放射性肺纤维化发生和发展密切相关的细胞因子，是一类具有调控细胞周期、早期发育、分化、免疫功能及诱导凋亡的多功能细胞因子。大量体内体外试验证明TGF-β1在细胞凋亡中发挥了重要作用，其可以诱导多种细胞发生凋亡[3，5]。在肺组织中，肺泡上皮细胞通过释放TGF-β1导致纤维化发生，并且TGF-β1又可通过抑制巨噬细胞分泌的胰岛素样生长因子1来促使上皮细胞凋亡，从而加速纤维化的进程。TGF-β1还参与成纤维细胞的增殖和分化，诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，导致肺纤维化，同时参与EMT的诱导[12]。因此，TGF-β1在放射性纤维化发生、发展中起到重要作用。

IL-6是具有多种功能的细胞因子，参与调节急性炎性反应。IL-6可由多种细胞产生，包括B细胞、T细胞、单核巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及肿瘤细胞。有研究发现照射区肺组织中的IL-6 m RNA水平明显上调[13]。因此，IL-6参与了放射性肺炎的发生。

1.4 基底膜破坏 基质金属蛋白酶(matrixmetallo proteinases，MMPs)是一类蛋白水解酶，能特异的降解细胞外基质，参与了多种纤维化疾病的发展过程，其在放射性肺纤维化中的作用也引起人们的注意，尤其以MMP-2、MMP-9较重要。在RILI发生时，检测到MMP-2、MMP-9的表达上调，两者可以降解Ⅳ型胶原(基底膜的成分)，因此导致了基底膜破坏。基底膜破坏可能促进胶原蛋白的沉积，从而促进了放射性肺炎向纤维化进展。但具体的调节机制仍然不清楚[8，14]。

1.5 氧化应激 当肺一旦暴露于射线下，就会发生氧化应激反应，产生氧自由基和活性氧。氧自由基是人体内水产生的，具有很强的破坏性，可以破坏各种化学键和DNA双键，是一种有害物质。这些氧自由基和活性氧损害肺组织，尤其是上皮细胞和内皮细胞，使细胞凋亡和上皮屏障功能破坏，导致RILI的发生。实验证明，射线照射后肺内产生的大量活性氧可以直接破坏蛋白质并产生羟基自由基，进而引起DNA损伤[15-16]。此外，活性氧可以破坏线粒体DNA并诱导炎症和免疫反应[17-18]；还可导致细胞丢失，增加上皮细胞的血管通透性、蛋白质渗出和细胞凋亡[5]。

2 干细胞治疗

干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞。而所谓干细胞治疗，就是利用人体干细胞的分化和修复原理，把健康干细胞移植到患者体内，以达到修复病变细胞和重建功能正常的细胞和组织的目的。目前，临床上主要采用自体干细胞移植，无免疫排斥及交叉感染，是一种简单、安全的治疗方法。现就利用间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治疗RILI作一叙述。

2.1 概述 MSCs是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我复制能力和多向分化潜能，可诱导分化为脂肪、软骨及其他组织类型细胞。MSCs可以接受移植，并且他们在部分组织中会迁移到病变部位分化为组织特异性功能的细胞，例如肺上皮细胞[19，21]，平滑肌细胞[20-21]。已有实验证明，MSCs利用细胞因子分泌与分化等特性修复损伤的组织器官[21-22]。

2.2 优点 MSCs的优势可概括为以下4个方面：(1)容易获得；(2)可以归巢并植入受损组织；(3)具有广泛的增殖和分化能力；(4)免疫原性低。正因为这几大优势，MSCs可以成功地跨越免疫屏障移植。越来越多的研究证明MSCs治疗肺损伤存在2个主要优点：(1)MSCs可以参与调节免疫反应，促进抗炎；(2)MSCs可以在全身给药后迁移到损伤部位，它们中的一部分会分化成相应的组织细胞以替代损伤的肺组织，促进肺组织的修复[23]。先前MSCs与辐射肺活检组织共培养的体外实验证明了MSCs可以分化为上皮细胞的能力，虽然MSCs具有分化的能力，但它们在组织中很快被免疫系统清除，且可以通过分泌细胞因子来促进组织修复[24]。

2.3 用于治疗RILI的MSCs分类及其治疗机制

2.3.1 骨髓MSCs治疗RILI的机制 骨髓MSCs是骨髓内存在的一类非造血干细胞，其在体内外具有支持和调控造血的作用，并且在体内可分布于多种组织和器官，具有多向分化潜能，因此目前其在医学上难以攻克的一些疾病方面具有重大应用潜力。骨髓MSCs在治疗RILI中可能存在的机制有以下几点。(1)具有抗辐射特性。有学者在小鼠组织中研究了骨髓MSCs对辐射的反应，骨髓MSCs具有更高的体外存活率和抗辐射能力[21]。骨髓MSCs通过产生抗氧化酶(如超氧化物歧化酶1、3，锰超氧化物歧化酶)降低氧化应激和活性氧水平，保护肺免受辐射诱导的内皮损伤。此外，有实验证明骨髓MSCs在缺氧条件下抗辐射特性更加显著[25]。(2)具有高效的修复系统。电离辐射可导致DNA双链断裂直接破坏DNA结构，也可通过产生活性氧间接影响基因组DNA和线粒体DNA结构，损害DNA分子[26]。因此，放射治疗会导致不同形式的DNA损伤。其中最严重的是DNA双链断裂。研究表明，骨髓MSCs具有高效的DNA双链损伤修复系统[20，27]。(3)抑制上皮细胞EMT。先前有文献报道，存在于肿瘤环境中的MSCs可以促进癌细胞EMT[28]，例如乳腺癌[29]、胃癌[30]。一些MSCs整合到肿瘤中时受肿瘤微环境的影响，会转化为肿瘤相关MSCs，肿瘤相关MSCs会通过微环境的调节显示出更强的肿瘤促进能力，并且通过微环境中的分泌因子促进癌细胞EMT[28]。然而在炎症病灶中，MSCs通过旁分泌刺激对邻近细胞显示出有益的作用[20]。有研究报道，受伤的肺组织保留了骨髓MSCs在肺中的滞留，且骨髓MSCs能够在肺中分泌多种细胞因子，通过上调细胞因子的表达减轻局部损伤，刺激上皮细胞增殖，抑制上皮细胞EMT[23，25，31]。而且骨髓MSCs可释放高水平的生长因子，如VEGF，有利于伤口的愈合[23]。(4)下调内皮细胞MMP-2的表达。Klein等[32]发现电离辐射后引起内皮细胞MMP-2表达上调，破坏血管结构，而MSCs可以减少内皮细胞MMP-2表达水平，使血管功能正常化，减轻血管结构的破坏。

2.3.2 人脐带MSCs治疗RILI的机制 脐带在临床上属于医疗废物，来源广泛，取材方便，分化潜力大，增殖能力强，具有明显的优势。人脐带MSCs能抑制肿瘤的生长及转移，同时能减轻肝纤维化和肾损伤[33-34]。而其在治疗RILI中可能存在的机制有以下几点。(1)降低IL-1的水平。在发生RILI时IL-1、TGF-β1等短暂升高已在小鼠模型中证实，并且IL-1有促进炎症和纤维化的作用，可加重病情[23]。有研究证明，人脐带MSCs能抑制单核巨噬细胞分泌IL-1，降低IL-1的水平可以减轻RILI的进展[35]。但MSCs抑制IL-1分泌的机制还不清楚。(2)合成IL-10。IL-10是由单核巨噬细胞产生的体内强有力的抗炎因子，它能抑制巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的活性，抑制Th1反应，并促进抗炎分子的分泌，抑制炎症反应，促进肺组织的修复，减轻RILI的进展[25，36]。人脐带MSCs进入体内可以合成和分泌IL-10，提高抗炎因子的水平。然而，IL-10也是最有争议的细胞因子，关于其在MSCs中的分泌存在矛盾的结果[21]。(3)抑制肺泡上皮细胞EMT。Wnt信号通路在细胞分化和增殖中起着至关重要的作用，TGF-β1和Wnt信号通路之间的协同作用可以诱导肺泡上皮细胞经历EMT[35]。Zhang等[37]进一步研究了人脐带来源的MSCs和Wnt通路之间的联系，并发现正常的肺成纤维细胞与脐带来源的MSCs的共培养削弱了Wnt/β-连环蛋白信号的激活，并且张春阳等[38]通过研究也发现MSCs可抑制放射线照射后小鼠肺组织内Wnt/β-catenin信号通路的活化。因此Wnt/β-连环蛋白信号成为了减弱RILI的潜在治疗靶点。

2.3.3 人脂肪MSCs治疗RILI的机制 人脂肪MSCs通过分泌前列腺素E2(prostagandin E2，PGE2)和肝细胞生长 因 子(hematopoietic growth factor，HGF)下 调TGF-β1

[25]。人脂肪MSCs分泌的HGF可能通过结合c-Met增加细胞内Smad7的水平，并通过以PI3K/Akt/p70依赖的方式上调损伤部位MMP-1、MMP-3和MMP-9的表达，从而促进肌成纤维细胞的凋亡，抑制EMT[23]。Dong等[39]也观察到人脂肪MSCs可以通过分泌HGF来保护Ⅱ型肺泡上皮细胞免受辐射诱导的EMT。人脂肪MSCs分泌的PGE2可促进抗炎因子IL-10的产生。此外，PGE2可抑制TGF-β1诱导活化的成纤维细胞增殖，并且PGE2还通过增加阻断PI3K/Akt信号通路的PTEN蛋白活性诱导肌成纤维细胞凋亡。这些发现表明，人脂肪MSCs通过激活抗炎通路和旁分泌因子的方式抑制纤维化[23，40]。

Jiang等[40]发现，人脂肪MSCs可以降低血清IL-1、IL-6和肿瘤坏死因子α水平，下调照射肺组织中TGF-β1和1型胶原水平来缓解RILI。

3 小结与展望

RILI是多因素造成的结果，表现为照射后引起多种靶细胞损伤，细胞损伤后立即引起细胞因子释放、氧化应激等现象，最终导致细胞凋亡。MSCs取材简单，分化潜能大，增殖能力强，免疫原性低，可作为靶向细胞应用于临床，是治疗RILI的重要部分。

虽然MSCs已经被越来越多的用于许多疾病的治疗，但其用于RILI的具体机制还不是很清楚，MSCs治疗后主要表现为炎症反应降低，纤维化缓解。然而，MSCs也可能促进组织纤维化。在辐射后立即注入肺中的MSCs会分化为功能性的肺细胞，但在辐射后后期再注入就可能参与纤维化的发展，推测与后期微环境改变和TGF-β1水平升高有关[41]。因此，MSCs治疗RILI的时间窗也是至关重要的。

值得注意的是，无症状的放射性肺炎的RILI通常在严重纤维化发展的晚期被诊断出来，这可能很难用MSCs有效逆转。因此，基于MSCs的RILI治疗的潜在临床应用仍有很长的路要走。就RILI而言，我们仍然需要评估MSCs治疗的安全性、最佳剂量、给药时间和给药途径。此外，MSCs在实验动物中的治疗效果并不总是显示出令人满意的结果，因此还需要大量的实验去探讨。

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