新型冠状病毒基因组、蛋白质及疫苗的研究进展

张杰 唐华平

1潍坊医学院临床医学院 261053；2青岛市市立医院东院呼吸与危重症医学科266071

据WHO统计，截至2021年3月28日，全球累计确诊新型冠状病毒肺炎(COVID-19)126 372 442例，累计死亡2 769 696例[1]。当前，全球范围内COVID-19的确诊病例持续上升，造成了前所未有的医疗和社会经济危机，解开新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-Co V-2)生物学信息是及时有效抗击这种大流行的基础。目前已经确认SARS-Co V-2属于β冠状病毒，在全基因组水平上与冠状病毒序列相似程度高[2-3]。SARS-Co V-2的氨基酸序列与冠状病毒也有相似之处，通过对其编码蛋白的进一步研究，为防治工作奠定一定的基础。目前，一些有效的抗病毒候选药物和疫苗正在接受紧急研究，为早日战胜疫情带来曙光。

1 基因组的相关研究

SARS-Co V-2是一种基因组大小约为30 kb的包膜、阳性、单链的RNA病毒，隶属于冠状病毒科的sarbecovirus亚属，在sarbecovirus亚属内形成了一个独立的亚类[4-6]。约30 kb大小的基因组多达14个开放阅读框(open reading frame，ORF)[7]，基因组G+C含量为38%，基因组包含2个侧翼未翻译区和1个编码多蛋白的长ORF，基因组的排列顺序为：5'非翻译区(untranslated regions，UTR)、复制酶编码区(ORF1ab)、S基因、E基因、M基因、N基因、3'UTR和几个未经鉴定的非结构ORF，但是缺乏β冠状病毒特有的血凝素酯酶基因[4-5，8]。其中5'UTR、ORF1ab、S基因、E基因、M基因、N基因和3'UTR的基因预测长度分别为：265、21 291、3 822、228、669、1 260和229nt[9]。有关研究发现SARS-Co V-2的E基因、M基因、N基因与相关冠状病毒的序列同源性高(均大于90%)，最高的是E基因(98.7%)；但是S基因与相关冠状病毒的序列同源性最低，只有75%左右，显示出了较大差异[3]。有关学者还在S基因中发现了一些重组的证据，但没有证据表明重组促进了SARS-Co V-2的出现[2，10]。Kim等[11]采用了两种互补的测序技术，绘制了SARSCo V-2转录组的高分辨率图，全面认识了SARS-Co V-2的生命周期和致病性。采用最新生物信息学方法和更大规模的数据，从蛇基因组中2%的所有蛋白质编码基因扩展到脊椎动物基因组中10%的所有蛋白质编码基因并进行比较，发现SARS-Co V-2与蛇使用的相对同义密码子的差异不是最小的，反驳了蛇可作为中间宿主的说法，从侧面反映了在缺乏全面的数据或后续实验验证的情况下，应谨慎避免对数据作出过度解释[12]。研究发现蝙蝠、穿山甲和猫科类冠状病毒与SARS-Co V-2基因序列最为密切，这表明需要持续的监测和预警野生动物和家养动物中存在的病毒库，对于找到中间宿主及切断传播途径具有一定的意义[13]。

SARS-Co V-2是单链RNA病毒，每个复制周期都会出现突变，从27个SARS-Co V-2分离株中分离出6个基因型，表明已经发生突变，这种变异值得注意，今后要警惕任何快速突变导致疫情的再次暴发[14]。有学者对86个SARS-Co V-2的基因组进行了遗传分析，发现了编码区和非编码区的许多突变和缺失，从而为SARS-Co V-2遗传多样性和快速进化提供了证据[15]。Pachetti等[16]用GISAID数据库分析了220个基因组序列，发现了8个新的突变，而且在不同地区突变的位置及模式不同，这表明SARSCo V-2正在不断进化。COVID-19病死率可能因地理区域的不同而不同，因此要反映某些突变的存在可能与不同的病死率相关还需要进一步的研究来证实。此外，Kim等[17]在SARS-Co V-2基因组中确定了767个同义突变和1 352个非同义突变。一种新的SARS-Co V-2病毒分离株在刺突蛋白中携带一个点突变(D614G)，并在传染性上迅速超过其他分离株，进一步研究表明Spike蛋白中的D614G突变增强了病毒在人类细胞中的转导，在多个细胞系中，携带D614G突变的SARS-Co V-2转导细胞的效率是野生型的8倍[18]。病毒突变的生物学特征可能为致病机制提供宝贵的见解。分析SARS-Co V-2的基因，对于其起源、发病机制、治疗及预防具有重大意义。

2 蛋白质的相关研究

SARS-Co V-2的基因组可编码9 860个氨基酸[4]，其在氨基酸水平上与严重急性呼吸综合征病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-Co V)有差异，存在380个氨基酸替换，相关辅助蛋白质的氨基酸个数也不相等，这可能导致SARS-Co V-2的功能和致病性与SARS-Co V不同[19]。SARS-Co V-2包含16种病毒复制和发病所需的非结构蛋白(nonstructural protein，NSP)、4种结构蛋白[棘突蛋白(S)、病毒包膜(E)、基质蛋白(M)、核蛋白(N)]以及9种其他辅助因子[6]。5种重要蛋白的氨基酸长度分别为7 096个氨基酸(ORF1ab)、1 273个氨基酸(S蛋白)、75个氨基酸(E蛋白)、222个氨基酸(M蛋白)和419个氨基酸(N蛋白)[13，20]。

NSP2内有关结构域的稳定突变可能会导致高传染性，NSP3的不稳定突变可能是区别于SARS-Co V的重要标志[21]。NSP7b和NSP8可以影响宿主的免疫应答信号，其在进化过程中的功能变化可能影响感染人的能力[22]。NSP可以形成一种复制酶/转录酶复合物，其由多种酶组成，包括NSP3、NSP13和NSP10/NSP16等[7]。

S蛋白对病毒亚型及疫苗应答具有重要作用[6]。其能识别宿主细胞受体催化膜融合，在相关酶的作用下，被分成S1和S2亚单位。S1包含一个信号肽，其受体结合区(receptor binding domain，RBD)与受体结合；S2高度保守，包含融合肽和细胞质结构域，与人类SARS-Co V具有99%的同源性。因此，抗S2的广谱抗病毒肽有治疗病毒的发展前景[4]。最近的一项研究发现SARS-Co V-2进入宿主细胞需要丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)启动S蛋白，抑制TMPRSS2可阻止感染宿主细胞，这可作为一个抑制病毒传播的新治疗靶点[23]。有学者利用SARS-Co V S蛋白生成多克隆抗体，可以有效阻止SARS-Co V-2感染宿主细胞，为疫苗和病毒进入抑制剂的设计提供了蓝图[24-25]。SARSCo V-2与SARS-Co V S蛋白的RBD相似程度高，进一步研究发现二者都是利用人血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)受 体 进 入 宿 主 细 胞[3，9，23]。Monteil等[26]发现人类重组可溶性ACE2可以阻断SARSCo V-2早期阶段的感染，为治疗和预防提供了新方向，也间接反映出了SARS-Co V-2通过人ACE2受体进入宿主细胞。β冠状病毒家族中E蛋白、M蛋白是高度保守的蛋白质，而辅助蛋白似乎有更严格的进化限制[27]。另外SARSCo V-2病毒主蛋白酶是一种关键的辅酶，在介导病毒复制和转录中起着关键作用，可以作为病毒的一个有吸引力的药物靶点或新药先导[28]。这些发现有助于进一步了解SARS-Co V-2发病机制，分析SARS-Co V-2与其他冠状病毒蛋白的差异，为抗病毒治疗做铺垫。

3 疫苗的相关研究

虽然疫苗的研发无法影响第一波大流行，却在预防感染和第二次大流行上具有重大战略意义。疫苗种类主要包括经典的灭活疫苗、减毒疫苗、蛋白质亚单位和病毒样颗粒疫苗、基于病毒载体的疫苗以及新的基于DNA和m RNA的疫苗等，每种疫苗都有其自身的优缺点，所有疫苗都在同时开发[6，29-30]。有学者运用免疫原性预测模型鉴定出了具有高免疫原性的SARS-Co V-2多肽，通过肌肉注射或皮下注射将其传递给宿主以激发免疫反应是疫苗的研发一个重要方向[31-33]。随后有关学者发现冠状病毒3CL水解酶是病毒蛋白水解酶成熟所必需的，利用3CL水解酶结合佐剂增强免疫应答，通过短肽连接体相互连接，可以构建多表位多肽疫苗[34]。回顾抗SARS-Co V RBD单克隆抗体和体外中和SARS-Co V病毒的研究发现，有开发针对SARS-Co V-2的异源SARS-Co V RBD疫苗的可能[35-36]。在动物实验中，灭活的SARS-Co V-2候选疫苗和DNA疫苗可为小鼠、非人类灵长类动物提供保护，以抵抗SARSCo V-2的攻击[37-39]。有趣的是，一种新型的诱骗性细胞疫苗利用表达SARS-Co V-2 S蛋白的非复制细胞作为免疫原性抗原的载体和呈现者，被宿主免疫系统识别，从而产生有效的保护性免疫应答，采用这一创新策略可以开发一种新型疫苗来预防SARS-Co V-2感染[40]。有关学者认为理想情况下，可以开发出一种能够预防多种冠状病毒的疫苗，即“泛冠状病毒”疫苗。这种疫苗不仅可以预防目前已知的冠状病毒，而且可以预防那些未来出现的新的冠状病毒[41]。

2020年3月，美国开始了一种新型的mRNA疫苗(m RNA-1273)Ⅰ期临床试验[42]，希望可以在预防SARSCo V-2中发挥作用。DNA和mRNA疫苗更容易设计并很快进入临床试验，但是在疫苗进入临床之前还需要科研人员验证其安全性[43]。在验证疫苗安全性上，Zhu等[44]通过人体试验发现重组腺病毒5型载体疫苗是相对安全、可耐受和具有免疫原性的，其具有较大的发展潜力。随后我国在603名成年志愿者中开展了腺病毒5型载体疫苗的Ⅱ期随机双盲试验，在单次免疫后大多数接受者有了相当大的体液和细胞免疫反应，说明该疫苗是安全有效的[45]。目前已报道了数百种SARS-Co V-2候选疫苗，其中有许多处于Ⅱ期临床试验，有些已经进入Ⅲ期临床试验。在一项有关牛津大学开发的载体疫苗Ch Ad Ox1随机对照的Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，所有1 077名参与者均诱导出了针对SARS-CoV-2的中和抗体，表明该疫苗不仅是有效的，而且具备一定的安全性。目前，美国辉瑞公司和德国Bio NTech公司的m RNA疫苗BNT162b2正在美国、英国和加拿大等地区进行接种。美国莫德纳公司的m RNA-1273、俄罗斯卫生部研制的Sputnik V和英国阿斯利康公司的AZD1222在其Ⅲ期试验中也取得了巨大成功，正在考虑紧急使用[46]。我国被认为是SARS-Co V-2疫苗研发的世界领先国家之一。截至目前，附条件批准上市的有3款利用非洲绿猴肾细胞研发的灭活疫苗、1款利用5型腺病毒研发的腺病毒载体疫苗及获批紧急使用的1款利用我国仓鼠卵巢细胞研发的重组亚单位疫苗。我国的疫情防控取得了举世瞩目的成绩，然而病毒基因组的突变在限制疫苗的使用寿命方面起着重要作用，相关疫苗还在试验阶段，需要国际合作应对控制COVID-19疫情的重大挑战。

4 展望

通过有限的治疗和预防措施，抗击来历不明、生物学特性神秘的SARS-Co V-2，是一项具有挑战性的任务。对于控制COVID-19疫情，研究SARS-Co V2的基因组和蛋白质结构是必不可少的。所有这些知识将为疫苗和抗病毒治疗的发展铺平道路。相信在我们的共同努力下会早日战胜疫情。

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