耳聋基因遗传学诊断技术研究进展

李惠勤，龙 驹

（钦州市妇幼保健院医学遗传科，广西 钦州 535099）

耳聋是一种可导致语言交流障碍的遗传性疾病。研究显示，我国残疾人约占全国总人口的6.34%，其中听力残疾个体2 004万，占24.16%[1]。听力残疾的患者中，由遗传原因导致的耳聋占比较高，每1 000名新生儿中至少有1名为听力障碍患儿，其中半数为遗传因素所致[2]。新生儿听力筛查是发现散发型听障儿童的重要方法，耳聋基因检测则是遗传性耳聋防控的有效措施。遗传性耳聋是一种分子机制相对明确的遗传病，对遗传性耳聋基因携带者及其家属成员进行准确的耳聋基因分析，是诊断遗传性耳聋的重要途径[3]。随着遗传学诊断技术的进步，遗传性耳聋的基因诊断技术也在不断的提高，本文对耳聋基因的实验室诊断技术进行综述，旨在为减少遗传性耳聋的发生提供理论依据。

1 耳聋的遗传学机制

遗传性耳聋分为非综合征性耳聋（non-syndromic hearing impairment，NSHI）和综合征性耳聋（syndromic hearing impairment，SHI），大部分NSHI由单纯的耳聋相关基因突变所引起，约占耳聋患者的70%，而SHI则是由各类遗传综合征所并发的听力障碍，约占耳聋患者的30%[4]。其中大多数SHI患者发病率较低，除听力障碍外，可伴有神经系统、皮肤等其他器官的异常，种类繁多且较为复杂；NSHI相关基因的变异是遗传性耳聋的主要检测目标，根据其发生变异的遗传物质构成，主要分为由线粒体DNA变异机制和由染色体组变异机制引起的耳聋[5]。

1.1 线粒体DNA变异所致的NSHI 药物性耳聋是指患者通过口服或者注射特定药物引起神经损害，造成听力障碍，在药物性耳聋中，由氨基糖苷类抗生素导致的药物性耳聋占比较高，遗传学机制是线粒体DNA变异，其中主要由线粒体12 srRNA基因变异引发，主要为1 494或1 555碱基变异[6]。此外，线粒体遗传遵循母系遗传规律，可由母系遗传给下一代[7]。

1.2 染色体组基因变异所致的NSHI 染色体组中存在大量与耳聋相关的基因，这些基因的突变会导致耳聋的发生。至2020年12月，共有122个NSHI相关基因被检出，其中常染色体显性基因50个、常染色体隐性基因76个、X染色体相关基因5个[8]。国内的商品化检测试剂盒主要针对GJB2基因、GJB3基因及SLC26 A4基因（与大前庭水管综合征相关）的热点突变为主。

2 耳聋的遗传学检测方法

部分SHI由染色体基因组的大片段碱基缺失或重复、多基因的联合作用引起，因此需借助高通量的DNA分析技术；而大部分NSHI由碱基突变引起，因此以检测基因单核苷酸多态性（SNP）的变异为主[9]。由于遗传性耳聋涉及的SNP变异较多，一般采用能够批量分析SNP的检测方式完成，包括染色体拷贝数变异测序（CNV-seq）和高密度SNP基因芯片技术、全外显子组检测（WES）和二代测序技术（NGS）、多重连接探针扩增技术（MLPA）、反向斑点杂交技术（RDB）、变性高效液相色谱分析法（DHPLC）、微阵列基因芯片检测技术、实时荧光检测技术、片段分析技术、飞行时间质谱技术、Sanger测序等。

2.1 CNV-seq和高密度SNP基因芯片技术 CNV-seq和SNP基因芯片检测技术是两种较为成熟的检测拷贝数变异（CNV）的技术，其中CNV-seq是一种采用高通量测序技术结合低深度全基因组测序对拷贝数变异（CNV）进行检测的方法，SNP基因芯片技术则是使用高密度芯片对目标位点进行分型，进而判断CNV的技术。CNV-seq可以检出大于100 kb的染色体片段的缺失或者重复变异[10]。MORGAN等[11]采用CNV-seq技术研究了686名耳聋患者，其中15.2%的患者至少携带1个CNV，而在已经明确由遗传因素导致的耳聋患者个体中，所涉及的STRC和OTOA基因中CNV最为常见。有相关研究显示，对225例NSHI患者进行SNP基因芯片技术检测，初筛中找到有明确致聋基因患者111例，占比49.3%，接近理想目标（60.0%），耳聋基因携带者30例；筛查结果均为阴性者84例，SNP基因芯片技术检测结果经Sanger测序验证，符合率高达100.0%，故SNP基因芯片检测技术准确度较高[12]。但SNP基因芯片技术操作相对复杂，且CNV-seq的检测平台（如illumina测序仪）也已经被广泛部署于聚合酶链式反应（PCR）实验室，因此新检测方案的研发多以CNV-seq平台为主。

2.2 WES和NGS WES和NGS的分析均是基于二代测序平台完成的检测。WES是一种只针对外显子区域DNA的新型基因组分析技术，首先将全基因组外显子区域DNA捕捉并收集，再进行高通量测序，然后结合生物信息学分析鉴定罕见和常见的与疾病相关的致病基因。NGS能一次对几十万甚至几百万条DNA分子进行序列测定，就耳聋基因研究和基因诊断而言，基于靶向捕获和高通量测序，可针对绝大多数已知耳聋基因进行一次性全序列突变检测[13]。所不同的是，WES是对人类所有已知基因的外显子进行检测，而NGS则是针对特定的基因进行检测。两种检测技术类似，但WES主要是针对未知致病原因的筛查，而NGS则更具有针对性。 DANA等[14]采用NGS和WES对有耳聋症状的个体进行了筛查，其中发现STRC的变异最为常见，同时也发现MYO15 A、LOXHD1、TMPRSS3、OTOG及OTOF基因突变。此外，也在部分患者中发现 AIFM1、CABP2、DIAPH1、PTPRQ、RDX、SLC26 A4、TBC1D24、TECTA 及 TMC1 突变导致个体耳聋的证据。但由于WES检测费用的逐年降低，且WES的检测范围较大，可有效提示基因组中未知的SNP基因变异，因此基于高通量测序的WES技术逐步被使用于排查未知基因变异的原因所导致的遗传性耳聋。

2.3 MLPA MLPA是一种使用特定的探针和引物进行杂交，对待测的DNA片段进行定量或定性的检测技术。部分遗传性耳聋患者是由于染色体的微缺失变异而引起，而这类变异用常规测序手段检测较为困难。 MARKOVA等[15]使用MLPA结合SNP芯片技术，对患者中STRC基因突变进行了研究，结果表明， STRC基因突变是听障患者隐性遗传性耳聋的重要致病原因。 KURTULGAN等[16]使用MLPA的方法，筛查了土耳其锡瓦斯人群中涉及的GJB2、GJB3、 GJB6基因变异，对锡瓦斯听障患者在这几个基因变异的致病性进行了评估。 MLPA在检测特定位置的CNV的使用中较为有效，但由于特定位置的变异在人群中检出不高，因此多使用该技术作为验证或者备用检测方案。

2.4 RDB RDB是一种采用特定的生物素结合探针于生物膜上，经过扩增、杂交等一系列方法检测目标片段的技术。结合PCR-RDB是检测已知单核苷酸变异的有效手段，在以单核苷酸变异为主的NSHI基因检测中较为有效。采用RDB技术开发的检测试剂盒比较多，但操作相对繁琐，若操作人员失误就可能会对实验室产物产生污染。但RDB法判读基因型相对简单，在基层实验室的部署相对容易，因此比较适合小规模的患者检测使用；但目前二级防控实验室在前期开展遗传性耳聋基因检测时，大部分选择PCR-RDB检测技术用于前期探索[17]。相关研究显示，从本质上，PCR-RDB和PCR- 导流杂交法的原理类似，判读方法和适用范围也类似[18]。

2.5 微阵列基因芯片检测技术 微阵列基因芯片检测技术是较早被用于检测遗传性耳聋的技术，主要被用于单碱基变异的检测。其技术特点为检测流程、判读方法均较为简单，并且能实现单次检测10～20个热点突变。目前已经有较成熟的商品化基因芯片检测试剂盒，单次可完成GJB2、GJB3、12 srRNA、SLC26 A4基因中 15个热点突变的筛查，在实际应用中效果显著[19-20]。巫静帆等[21]应用可检测GJB2、SLC26A4、12 srRNA及GJB3基因中9个热点突变的微阵列基因芯片检测技术，完成了33 810例新生儿足跟血的检测，共检出1 145例携带突变等位基因的个体，因此微阵列基因芯片检测技术也可以使用于大规模人群的耳聋基因筛查。由于微阵列基因芯片面世相对较早，虽然其能检测的热点突变数量有限，但也有一部分二级实验室一直沿用该技术作为常规耳聋基因检测手段。

2.6 实时荧光检测技术 在耳聋基因检测中，采用实时荧光检测技术的检测方案包括采用多色溶解探针检测技术（MMCA）、基于Taqman探针的实时荧光检测技术。MMCA的原理为针对突变位置设计引物和标记探针，根据探针结合时的溶解曲线温度对目标位置进行基因分型。采用实时荧光检测操作可以有效避免PCR扩增产物的污染，若配合自动化判读软件，则判读结果相对简单[22]。但是该方法单管检测SNP具有局限性，当检测的目标热点突变较多时，需要使用较多的检测管方可完成单样本分析。若单批次的待测样本较多时，需要多台的PCR仪同时参与检测，该方法检测通量相对较低，因此更适合小型实验室采用[23-24]。与MMCA相比，基于Taqman探针的实时荧光检测技术的检测通量更低，因此基于Taqman探针的实时荧光检测技术更适合用于特定突变点的验证[25]。

2.7 DHPLC DHPLC又被称为温度调节的杂合双链分析（TMHA），是一种自动化、高通量的基因突变筛查新技术，利用该技术可以对目标片段DNA的差异进行检测[26]。在高通量测序普及之前， DHPLC已被证明是一种精确、快速、高效的检测已知突变和筛查未知突变的方法，但由于该技术成本较低，也常用于人群等位基因频率的研究[27]。随着高通量测序技术的普及和成本的降低，且目前该设备大部分被医学研究实验室购置，有注册证的试剂较少，因此DHPLC技术在耳聋基因检测的应用尤其是临床上的应用逐步减少，目前主要被应用于医学研究中[28]。

2.8 片段分析技术 片段分析技术主要指基于荧光PCR- 毛细管电泳法，使用特异性引物扩增技术（AMP-PCR）检测单核苷酸变异。通过设计的针对特定SNP特异性标记引物，PCR扩增后采用毛细管电泳仪检测，可以达到分辨1～2个核苷酸差异的片段，最后通过荧光信号判断目标SNP的分型[29]。该技术通量适中，适合于检测范围为10～50个SNP的多重PCR检测。基于荧光标记的毛细管电泳技术在耳聋基因检测中已有一定的应用[30]。目前也有一些商业检测机构开发了基于片段分析技术的遗传性耳聋基因检测商用试剂，其检测范围与PCR-RDB法的相似，主要优势在于防止PCR气溶胶污染能力比PCR-RDB法强，但大部分试剂仍然在做注册证申报中，因此自主使用该检测手段的机构较少。在实际应用中，若检测机构配备有毛细管电泳仪，则可以较为灵活地使用该检测技术。

2.9 飞行时间质谱技术 飞行时间质谱在耳聋基因检测中已有应用，兰莉等[31]采集了85例贵州省的人工耳蜗植入患儿的样本，采用飞行时间质谱技术进行了20个热点耳聋基因的SNP分型，共检出25名个体携带热点耳聋基因突变；阙婷等[32]对广西7 100例新生儿使用自动判别听性脑干诱发电位（AABR）进行初筛、复筛，阳性个体采用飞行时间质谱技术进行20个耳聋基因热点突变进行检测，共检出251例阳性携带者个体。因此，飞行时间质谱技术在耳聋基因的检测中也得到了一定规模的应用。

2.10 Sanger测序 Sanger测序是目前耳聋基因检测的金标准。在商品化试剂盒的研发和新耳聋突变的发现中，均需要以Sanger测序作为最后的判定标准，如任淑敏等[33]通过使用NGS技术后，在一个家系的两名耳聋患者中找到了GJB2基因的IVS1+2 T ＞ A变异，并采用Sanger测序进行了验证，证明了该变异是GJB2基因新发现的致病性变异。叶敏南等[34]采用Sanger测序法为金标准，对一种包含4个耳聋基因的20种基因突变的PCR-RDB法检测试剂盒进行了验证，验证了该试剂盒的性能指标，包括阳性符合率、阴性符合率、总符合率、灵敏度、特异性、阳性预测值及阴性预测值等，认为该试剂盒的性能指标符合标准。因此，Sanger测序法在当前阶段的耳聋基因检测中仍然具有重要的意义。

3 小结与展望

在耳聋基因检测中，需要遵循患者表现型与基因型检测结果相符的准则。通常情况下，当患者或其家属有耳聋症状时，首先采集先证者的生物学样本，优先采用PCR-RDB法、微阵列基因芯片法、溶解曲线法、飞行时间质谱法或者其他检测热点突变的方法，对受测者是否携带中国人群常见耳聋热点突变基因进行检测。当受测者的表现型与检出的基因型不符时，进一步采用全外显子检测技术结合CNV-seq技术对该样本进行分析，若存在疑似变异基因再用Sanger测序法进行验证。各基层检测实验室根据自身实际情况选择筛查热点耳聋基因的检测方案，当需要进一步验证时则送至有条件的专业实验室或科研机构完成。耳聋作为一种致残的遗传疾病，目前正逐步引起各专业防控机构的关注，随着各检测实验室检测条件的改善，耳聋基因检测技术在国内各检测机构逐渐普及，耳聋基因在人群中的频率逐步被揭示，各种可导致耳聋的基因变异也被逐渐发现。未来，在各临床机构的共同努力下，新发耳聋在人群中的占比将逐渐降低。