miR-18b-5p靶向HMBOX1调控前列腺癌细胞增殖、凋亡的分子机制

叶旭明 牛洪流 赵建军

前列腺癌(prostate cancer，PC)是男性中第二大常见的恶性肿瘤，也是全世界与癌症相关的死亡的第五大主要原因[1]。在过去的十年中，中国前列腺癌的发病率和病死率显著增长[2]。尽管在早期发现以及临床管理方面取得了很大进展，但仍有30%的PC患者在PC根治术或辅助治疗后复发[3]。因此，迫切需要寻找更有效的生物标志物或治疗靶点来预防、诊断和治疗PC。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小的内源性非编码RNA，可通过mRNA降解或翻译抑制作用在转录后充当其靶基因的负调控因子。据报道，许多miRNA通过调节PC各种生物学过程(例如增殖、迁移和凋亡等)成为肿瘤抑制因子或癌基因[4]。由于在PC的肿瘤发生发病机制中起着至关重要的作用，miRNA在PC的预测、诊断和预后生物标志物或治疗靶标上显示出巨大的潜力[5]。miR-18b-5p是近年来发现的miRNA，在肿瘤(如乳腺癌，肺腺癌和卵巢癌等)的发生和发展中发挥至关重要的调控作用[6-8]。近期Verma等[9]通过CS-miRTar数据库和miRNA芯片微阵列分析显示，miR-18b-5p在PC组织的表达下调。然而，miR-18b-5p在PC中的作用及可能的机制鲜有报道。因此，本实验旨在探究miR-18b-5p对PC细胞增殖和凋亡的影响，以期为PC的诊断、治疗及预后提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 前列腺癌细胞系DU145(美国菌种保藏中心)；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；miR-18b-5p mimics、miR-18b-5p inhibitors及相应对照(广州市锐博生物科技有限公司)；胰蛋白酶、胎牛血清和Lipofectamine 2000脂质体转染试剂(美国Invitrogen公司)；Trizol试剂、逆转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix检测试剂盒(赛默飞世尔科技有限公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(美国Promega公司)；HMBOX1野生型(HMBOX1-Wt)及HMBOX1突变型(HMBOX1-Mut)荧光素酶重组载体质粒(上海生工生物工程有限公司)；MTT试剂(美国Sigma公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒、ECL检测试剂(碧云天生物技术研究所)；HMBOX1抗体(美国Abcam公司)；辣根过氧化物酶标记的IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 前列腺癌DU145细胞的体外培养和转染 前列腺癌DU145细胞常规复苏后接种到体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640的培养基中，孵育箱培养条件为：体积分数5%CO2、100%湿度、37℃。每隔1 d更换1次新的培养液，待细胞呈单层融合时，以胰蛋白酶消化并传代。转染前1 d将生长状态良好的DU145细胞接种到6孔板中，过夜孵育，待细胞生长汇合达80%以上时进行转染，采用50 μl不含血清的培养液稀释miR-18b-5p inhibitor或相应对照，另外，采用50 μl不含血清的培养液稀释Lipofectamine 2000，各自孵育30 min，将两种稀释液进行混合，孵育20 min，将混合液加入到相应每孔细胞中，转染48 h后，分别收集各组细胞用于相关指标检测。其中转染miR-18b-5p inhibitor的DU145细胞设为anti-miR-18b-5p组，转染对照的DU145细胞设为NC组，未行转染的DU145细胞设为空白对照(Mock)组。

1.3 qRT-PCR实验 收集各组DU145细胞，加入Trizol试剂分别抽提总RNA，随后测定RNA的纯度，使用逆转录试剂盒将RNA合成第一链cDNA，调整cDNA浓度，使用SYBR Green PCR Master Mix检测试剂盒进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5 min，随后94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共循环40次。以相对对量2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，以U6为内参对miR-18b-5p定量，以GAPDH为内参对HMBOX1定量。见表1。

表1 qRT-PCR检测所需引物

1.4 双荧光素酶报告基因实验 采用TargetScan软件预测miR-18b-5p的靶基因，结果显示HMBOX1与miR-18b-5p存在靶向结合序列。构建HMBOX1 3’UTR的野生型(HMBOX1-Wt)和突变型(HMBOX1-Mut)荧光素酶重组载体。将DU145细胞接种到6孔板中，过夜培养，待细胞贴壁后将miR-18b-5p mimics和其对照分别与HMBOX1-Wt或HMBOX1-Mut重组载体共转染，培养48 h后收集细胞，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒分别测定萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，分析细胞的相对荧光素酶活性。

1.5 MTT实验 用胰蛋白酶消化各组DU145细胞，收集并计数，将细胞密度调整为1×104个/ml，以100 μl/孔接种到96孔板中，培养48 h后，加入100 μl MTT溶液，37℃孵育4 h，除去MTT溶液，在加入150 μl DMSO，振荡至沉淀完全溶解，在酶标仪490 nm处各组细胞吸光度(OD)值，以OD值的大小反映细胞活力的高低。

1.6 克隆形成实验 各组DU145细胞以胰酶消化，离心收集并计数，以1×103个/孔接种到6孔板中，添加新的培养液，放置在37℃培养箱培养，每隔1 d更换液1次，培养14 d左右，待观察到细胞克隆形成时终止培养，除去培养液，以4%甲醛固定，结晶紫染色，洗去染液风干，在显微镜计数(>50个细胞的克隆)细胞克隆数，计算各组细胞克隆形成率，克隆形成率(%)=克隆形成数/接种细胞数×100%。

1.7 流式细胞术 收集转染48 h后各组DU145细胞，以预冷的PBS洗涤2次，计数约1×105个细胞，添加100 μl结合缓冲液悬浮各组DU145细胞，再分别添加AnnexinⅤ-FITC和PI染液5 μl，充分混匀，于室温下避光染色15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并采用CELL Quest软件分析细胞凋亡率。

1.8 Western blot实验 收集转染48 h后各组DU145细胞，加入裂解液冰上裂解15 min，提取总蛋白，蛋白以BCA试剂盒进行定量，蛋白样品于沸水中煮沸10 min致变性，取40 μg蛋白行10% SDS-PAGE电泳，分离蛋白后电转至PVDF膜上，随后封阻2 h，TBST漂洗3次，加入相应稀释的HMBOX1一抗(1∶800稀释)，4℃过夜孵育，再以TBST漂洗3次，加入稀释的二抗(1∶3 000稀释)，室温孵育2 h，滴加ECL进行显影，使用凝胶成像系统采集图像，以GAPDH作内参，Imag J软件分析各组DU145细胞中HMBOX1蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 瞬时转染下调DU145细胞中miR-18b-5p的表达 在DU145细胞中瞬时转染miR-18b-5p inhibitors 48 h，qRT-PCR分析结果显示，与Mock组比较，miR-18b-5p在anti-miR-18b-5p组DU145细胞中的表达量显著下调(P<0.05)，HMBOX1 mRNA在anti-miR-18b-5p组中的表达量显著上调(P<0.05)，而NC组miR-18b-5p和HMBOX1 mRNA的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组DU145细胞中miR-18b-5p和HMBOX1 mRNA表达量比较

2.2 miR-18b-5p靶向HMBOX1的预测和验证 TargetScan预测结果显示，HMBOX1的3’UTR与miR-18b-5p具有互补结合位点。双荧光素酶报告基因实验分析结果显示，过表达miR-18b-5p能够明显抑制HMBOX1-Wt的相对荧光素酶活性(1.00±0.10 vs 0.30±0.03，t=20.114，P<0.05)，而对HMBOX1-Mut的相对荧光素酶活性无显著影响(0.99±0.09 vs 0.98±0.09，P>0.05)。Western blot结果显示，与Mock组比较，HMBOX1蛋白在anti-miR-18b-5p组中的表达量明显上调(0.27±0.03 vs 0.52±0.05，P<0.05)。见图1。

2.3 抑制miR-18b-5p可抑制DU145细胞的增殖能力 MTT实验和克隆形成实验结果显示，与Mock组比较，anti-miR-18b-5p组DU145细胞活力和克隆形成率均明显降低(P<0.05)，而NC组细胞活力和克隆形成率差异不显著(P>0.05)。见表3。

表3 3组DU145细胞活力和克隆形成率比较

2.4 抑制miR-18b-5p可促进DU145细胞凋亡 流式细胞术检测结果显示，与Mock组比较，anti-miR-18b-5p组DU145细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，而NC组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。见表4，图2。

图2 流式细胞术检测DU145细胞凋亡情况

表4 4组DU145细胞凋亡率比较

2.5 下调HMBOX1逆转抑制miR-18b-5p对DU145细胞增殖和凋亡的影响 为探究miR-18b-5p是否通过负向调控HMBOX1影响DU145细胞增殖和凋亡，本实验在DU145细胞中共转染miR-18b-5p inhibitors和HMBOX1 siRNA，48 h后分别通过Western blot、MTT和流式细胞术检测HMBOX1蛋白表达水平、细胞活力和凋亡率，结果显示，与anti-miR-18b-5p组比较，miR-18b-5p+si-HMBOX1组DU145细胞中HMBOX1的表达明显升高(P<0.05)，细胞活力升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)。见表5。

表5 3组DU145细胞中HMBOX1表达水平、细胞增殖和凋亡比较

3 讨论

在过去的几十年中，PC一直处于全球男性恶性肿瘤死亡率的前列。雄激素剥夺疗法可用于PC的早期阶段，但是在治疗后，该疾病会发展为去势抵抗性PC[10]。然而，目前很少有能治愈去势抵抗性PC的有效疗法，因此，人们期望找出更有效治疗PC的方法。miRNA已被证明是癌症发展和进程中的关键调节剂。从功能上讲，miRNA参与许多生物过程的调控，例如细胞分化、增殖、凋亡和细胞周期控制等。根据细胞环境及其靶标，miRNA可以充当癌基因或抑癌基因[11]。miRNA在PC的发生发展中扮演重要角色。如Liu等[12]研究显示，miR-146a和miR-152在PC患者中异常表达，且与与临床分期，是否存在骨转移以及病理分期等密切相关。miR-3648在前列腺癌组织中过表达，过表达miR-3648通过靶向APC2促进了PC细胞系LNCaP的增殖和细胞周期进程[13]。以上这些研究显示，miRNA可能是PC的良好生物标志物。miR-18b-5p是一种与多种疾病(包括肿瘤)发展相关的miRNA，日益引起研究者的重视。本研究发现，过表达miR-18b-5p能够抑制PC细胞DU145的增殖，并促进细胞凋亡，这与以往研究相符，例如Xue等[14]的研究发现，miR-18b-5p能够抑制肺腺癌细胞的增殖。另一项研究显示，miR-18b-5p通过靶向VMA21抑制卵巢癌细胞的增殖和转移[15]。此外本实验证实miR-18b-5p对PC细胞增殖和凋亡的作用机制可能与靶向调控HMBOX1的表达有关。提示miR-18b-5p在PC中是一个具有潜力的肿瘤抑制因子。

大量研究证实，miRNA可以通过靶标mRNA降解或蛋白质合成抑制来调节基因表达，进而调节多种生理或病理过程，包括细胞增殖、分化、应激和死亡[16,17]。miRNA已在几种类型的癌症中得到鉴定，并且可以根据其靶基因而发挥正或负调节剂的作用[18]。本实验通过生物信息学软件预测发现，HMBOX1可能是miR-18b-5p的靶基因，并且过表达miR-18b-5p能够抑制HMBOX1 mRNA和蛋白的表达。HMBOX1是一种转录抑制因子，首先是从人胰腺cDNA文库中鉴定并分离出来，并且在人类组织和器官中广泛存在[19]。之后随着对HMBOX1的深入探究，发现其在调控组织分化、器官形成、肿瘤发生等中发挥重要作用。最近有报道指出，HMBOX1能够促进卵巢癌细胞增殖并抑制细胞凋亡[20]。HMBOX1在胃癌中呈高表达，且其高表达通过促进细胞增殖和迁移导致胃癌患者预后不良[21]。HMBOX1通过促进自噬，抑制癌症干细胞样表型和免疫逃逸来抑制肝癌的进展[22]。最近陈立等[23]研究显示，HMBOX1在PC组织中低表达，且可抑制PC细胞的上皮间质转化及迁移。然而HMBOX1对PC细胞的增殖和凋亡是否存在影响尚无报道。本实验结果显示，抑制miR-18b-5p能够阻碍DU145细胞的增殖并诱导细胞凋亡，该过程可能与靶向上调HMBOX1的表达有关。继而本实验采用共转染同时抑制miR-18b-5p和HMBOX1的表达，结果发现抑制HMBOX1能够部分逆转抑制miR-18b-5p对DU145细胞增殖和凋亡的影响。以上这些实验结果表明，miR-18b-5p通过靶向调控HMBOX1来调节DU145细胞的增殖和凋亡。

总之，本研究表明，miR-18b-5p直接靶向HMBOX1调节PC细胞DU145的增殖和凋亡。因此，miR-18b-5p可能是潜在的分子靶标，有望成为PC诊断和治疗的新靶点。