液态活检在胰腺癌早期诊断中的作用

熊光冰 王敏 朱峰 秦仁义

胰腺癌是一种临床发现晚、恶性程度高和预后差的消化系统恶性肿瘤[1]。其中，最常见的病理类型为胰腺导管腺癌。流行病学研究表明，其5年总体生存率在9%以下，分别位居我国和美国恶性肿瘤致死因素的第6位和第4位，并呈逐年上升趋势，预计于2030年成为美国第2位的肿瘤相关死亡原因[2]。根治性手术切除是胰腺癌目前唯一可能的治愈手段，但80%左右的病人在初次就诊时已不可切除或发生远处转移[3]。化疗是改善不能手术病人预后的重要治疗策略，然而以吉西他滨为基础的单药或联合用药方案并没有大幅度延长病人的总体生存时间，大部分晚期病人的中位生存时间仍小于1年。究其原因，早期临床症状不典型、缺乏灵敏且特异的早期诊断标志物是主要因素[4]。因此，研究用于胰腺癌病人早期诊断的肿瘤标志物，以提高早期诊断率和手术可切除率，对于改善病人预后具有重要的临床意义。

目前，临床上诊断胰腺癌的常用方法包括血液学检测、影像学检查及组织病理学分析。CA19-9是唯一被美国食品药品管理局批准用于胰腺癌诊断的血液学检测标志物，但随着对CA19-9的深入研究发现，CA19-9及其他消化道肿瘤标志物(如CEA、CA125、CA72-4等)对于胰腺癌早期诊断的灵敏度与特异度均不高，甚至在与慢性胰腺炎的鉴别诊断中可产生假阳性结果[5-6]。增强CT(contrast-enhanced computed tomography)和核磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)是临床上常用的影像学检查手段，但现有的研究证据表明，二者在胰腺癌早期诊断方面存在不足[6-7]。而在诊断方面具有较高灵敏度的正电子发射计算机断层显像(positron emission tomography/CT，PET/CT)因其昂贵的检查费用限制了其广泛的使用[6,8]。内镜超声引导下的细针穿刺(endoscopic-ultrasound guided fine-needle aspiration,EUS-FNA)是目前胰腺癌诊断的金标准，文献报道其灵敏度和特异度可高达86.8%和95.8%[9-10]。然而，一方面由于EUS-FNA属于复杂的侵入性操作，不仅具有操作并发症发生的可能(如肿瘤播散、胰腺炎、出血及消化道穿孔等)，还不易多次重复进行或部分病人不能满足操作要求；另一方面，因为胰腺癌特有的肿瘤间质成分，EUS-FNA仅能提供有限的肿瘤细胞进行病理相关细胞学分析，往往可能出现假阴性结果，且不能提供充足的组织完成肿瘤分子生物学研究以指导治疗策略的选择；从而导致EUS-FNA在胰腺癌诊断上的应用受限。因此，临床上迫切需要新技术或新的生物标志物用来辅助胰腺癌的早期诊断，并克服与侵入性检查相关的禁忌证。近年来的研究表明，液态活检(liquid biopsy,LB)作为一类新兴且热门的非侵入性检测技术，主要从病人血液中获得肿瘤的相关信息，主要包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)、循环肿瘤DNA(circulating- tumor DNA,ctDNA)及外泌体(exosomes)等的检测[4,11]，不仅在胰腺癌早期诊断中发挥潜在的优势，还可对病人的预后判断以及复发监测有一定的指导意义。

一、液态活检的主要检测内容

1.CTCs:CTCs于1869年被首次报道[12]，是指实体肿瘤因生长、或肿瘤细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、或外科手术操作挤压等原因，使部分肿瘤细胞穿过基底膜、细胞外基质及血管管壁等，从而进入外周血循环的肿瘤细胞[13]。其在外周血中数量罕见，每1×108个血细胞中约含一个，常呈现为单个细胞或细胞簇，大小为毛细血管径的2 ～ 4倍左右。近年来的研究表明，CTCs检测在胰腺癌的早期诊断方面扮演着重要角色，一方面肿瘤细胞可通过EMT过程在胰腺癌发生发展的最初始阶段就播散入血，如Rhim等[14]研究发现，在胰腺癌小鼠模型转化过程中，CTCs早于肿瘤组织病变为侵袭性原位癌而出现在外周血中，且CTCs在未恶变为胰腺癌的21例胰腺囊性疾病病人的外周血中有7例可检测出CTCs的相关标志物[15]。另一方面，现有的研究证据表明，CTCs与胰腺癌的原发灶和/或转移灶中的肿瘤细胞在基因组学和蛋白质组学方面存在相关性；可通过相关新兴技术对病人外周血中富集而来的CTCs进行深入的DNA、RNA及蛋白质等分子标志物检测分析以达到早期诊断目的[16-17]。

2.循环肿瘤DNA:ctDNA是肿瘤在发生发展中的各个阶段因为肿瘤细胞发生凋亡、坏死及自噬而释放到外周血中的一种特殊DNA片段，可由基因组DNA、线粒体DNA和非编码gDNA等组成[18-19]。与CTCs不同，ctDNA在病人的循环血中可被大量检测出来，其检测丰度为0.01%～93%，是与肿瘤负荷直接相关的测量值，可间接反映出肿瘤当前状态。越来越多的证据表明，ctDNA在胰腺癌早期诊断上具有重要的作用，其一，与健康受试者相比较，胰腺癌病人循环血中的ctDNA含量显著升高[20]。其二，尽管胰腺癌细胞的异质性较多样化，外周血中ctDNA检测出的胰腺癌特有的基因组学(KRAS突变)和/或表观遗传学(DNA甲基化)改变等[21-22]，与胰腺癌组织中的相应变化具有较高的一致性[23]。

3.外泌体:外泌体是细胞外膜泡的一种，常呈球状或柱状，大小约30～150 nm，密度为1.13～1.19 g/ml，多由正常细胞或肿瘤细胞因胞吐作用而分泌到细胞外或外周血中[24]。其包含大量的蛋白质、脂质和核酸(DNA、mRNA、microRNA及long non-coding RNA)等信号分子，是肿瘤细胞之间和/或与肿瘤微环境之间信号传导的重要途径，参与调控胰腺癌细胞的生长、侵袭、转移和耐药等[25]。有研究发现，外泌体可作为胰腺癌早期诊断的重要探索方向。首先，外泌体主要是活细胞所分泌，其在外周循环血中出现的时间早于因肿瘤细胞坏死而释放的ctDNA，理论上可在肿瘤早期阶段予以检测[26]。其次，虽然外泌体的检测丰度取决于肿瘤的状态和所研究的体液，但研究表明，胰腺癌病人循环血中的外泌体的数量显著高于健康受试者。然后，在肿瘤的各个阶段都可分泌的外泌体，因其天然的脂质双分子层模型保证了血循环中的高稳定性，且可携带大分子量的核酸或蛋白质等物质，并在其内部或表面上具有肿瘤特异性标志物，使其成为胰腺癌液态活检较好的检测内容[23]。

4.其他潜在的早期诊断标志物:有报道表明，外周血循环中的RNA、血小板及免疫细胞等都可能是胰腺癌早期诊断方面潜在的液态活检标志物[23]。循环血RNA的检测可提供胰腺癌在遗传学和/或表观遗传学等方面改变而导致的基因表达变化信息，较ctDNA检测更具肿瘤特异性，特别是非编码RNA检测，如多项研究已证实，microRNA(miRNA)检测在区分胰腺癌病人与健康人或其他胰腺疾病病人方面显示了非常高的准确性，可作为胰腺癌早期诊断的分子标志物[18,27]。血小板在肿瘤细胞生长、迁移、侵袭及血管生成等方面的重要调控作用，使其成为了胰腺癌早期诊断方面潜在的标志物，如Best等[28]通过对肿瘤病人血小板RNA进行测序，发现与55例健康受试者相比，288例肿瘤病人(35例胰腺癌)的诊断准确率可为96%；而对于胰腺癌的诊断，准确率可达100%。同时，也有文献报道，通过对血小板蛋白质组进行检测，可以区分早期胰腺癌病人和健康人[29]。免疫细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞、T淋巴细胞及自然杀伤细胞等，在胰腺癌的发生发展中扮演重要的角色，或参与机体免疫应答或被肿瘤细胞分泌的外泌体所调控。检测这些被调控后的免疫细胞则为胰腺癌的早期诊断提供了一个可能的契机，如Chen等[30]研究发现，经胰腺癌外泌体诱导后的树突状细胞在mRNA及lncRNA表达上与未诱导的对照组树突状细胞存在显著差异。

二、液态活检在胰腺癌早期诊断中的应用

1.CTCs与胰腺癌早期诊断：CTCs检测在20世纪90年代后期由于检测技术的进步再次成为了肿瘤领域研究的热点，并随之展现出了广泛的应用前景。美国食品药品管理局于2004年首先批准CellSearch系统用于转移性乳腺癌CTCs的检测，现被认为是CTCs检测研究的金标准[31]。在胰腺癌中，Allard等[32]于2004年，通过CellSearch系统首次在16例确诊为胰腺癌病人的循环血中的6例检测到CTCs的存在，而并没有从健康对照组中检测出CTCs的存在，这表明，CTCs检测在胰腺癌早期诊断中具有潜在的价值。然而，由于胰腺癌CTCs较其他肿瘤CTCs的特殊性(EMT过程中丢失检测标志物EpCAM和细胞角蛋白等)，有研究指出，CellSearch系统在胰腺癌诊断中的准确率为11%～48%，甚至在部分晚期胰腺癌病人中的检出率仅为32.3%[31]。为了进一步提高胰腺癌病人循环血中CTCs的检出率，在基于CellSearch系统的基础上多种新技术、新方法被运用于CTCs的相关检测，如Khoja等[33]运用ISET(isolation by size of epithelial tumor cells method)富集方法检测病人循环血中的CTCs，从而避免因CTCs表面标志物EpCAM等丢失导致的检出率低。与CellSearch系统相比，ISET方法在27例病人(80%为转移病人)中的检出率可达93%，CellSearch系统的检出率仅为40%。同时，越来越多的研究表明，采用不同检测方法的CTCs在Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌病人中的诊断敏感性可>70%，如Zhou等[34]采用免疫磁珠分离富集法检测胰腺癌病人循环血中CTCs，对25例病人诊断的灵敏性为96%，特异性为100%，其中，对5例早期胰腺癌病人的诊断率可为100%。Xu等[35]应用阴性富集结合免疫荧光原位杂交技术(negative enrichment and immunostaining-fluorescence in situ hybridization,NE-iFISH)，发现6/8的胰腺良性疾病(75%)和8/11的早期胰腺癌(73%)病人中存在CTCs(≥1)；Gao等[36]也采用同样方法的检出率可达12/13(92%)。Ankeny等[37]通过微流控法(Microfluidic)对72例胰腺癌和28例胰腺良性疾病病人进行CTCs检测研究显示，微流控法的敏感性为75%，特异性为96.4%。Kulemann等[38]进一步通过ScreenCell方法结合KRAS基因突变检测对58例胰腺癌病人和10例健康对照人进行CTCs检测研究，显示胰腺癌病人CTCs总体检测率为67%；而Kulemann等[39]采用同样检测方法的另一项研究则显示，早期胰腺癌的检测率可达80%(8/10)。综上，虽然上述研究结果表明CTCs检测在胰腺癌早期诊断中具有广阔的应用前景，但由于CTCs富集方法的不同和检测标志物的多样性，CTCs在胰腺癌早期诊断中的研究结果差异较大，仍需大规模的研究及统一的检测方法进一步探索其临床应用价值。

2.ctDNA与胰腺癌早期诊断：ctDNA在胰腺癌中的研究始于20世纪80年代，Shapiro等[40]首次在胰腺癌病人外周血中检测到ctDNA呈高表达状态(>100 ng/ml)，而Sorenson等[41]随后通过PCR法在3例胰腺导管腺癌病人血浆中证实了ctDNA的表达。进一步研究发现，胰腺癌病人血浆中ctDNA的表达水平与健康对照组、胰腺神经内分泌肿瘤或慢性胰腺炎病人等不同[26]。随着肿瘤临床分期的不同ctDNA的检出率也不同，如Bettegowda等[42]的研究显示，在155例胰腺癌病人中ctDNA的检出率随着TNM分期的上升而增加。这些研究表明，ctDNA可作为胰腺癌早期诊断的生物分子标志物。同时，近年来的研究显示，胰腺癌病人外周血中ctDNA的突变检测较ctDNA丰度检测的临床应用价值更重要。Zill等[43]对54例胰腺癌病人组织和外周血标本进行突变基因检测发现，ctDNA中可检测到与组织标本90%左右相同的基因突变类型。KRAS作为胰腺癌最重要的驱动基因之一，其在胰腺癌病人外周血中的突变片段可在近一半病人的血浆DNA中被检测到，而在健康人中几乎没有。因此，ctDNA中的KRAS突变检测可以作为胰腺癌早期诊断的生物标志物，如Sausen等[44]采用超敏微滴式数字PCR(ddPCR)技术对51例早期胰腺癌病人的ctDNA 中的KRAS 突变进行检测，结果显示,22例病人(43%)血浆ctDNA中具有KRAS基因突变， ctDNA KRAS突变检出率的诊断特异度大于99.9%。目前，大多数研究已经将胰腺癌ctDNA KRAS基因突变作为识别循环肿瘤DNA的检测标志之一。同时，近年来的研究也提示，ctDNA的甲基化检测也可作为胰腺癌的潜在标志物，如Henriksen等[45]通过对95例胰腺癌、97例慢性胰腺炎、59例急性胰腺炎和27例其它非胰腺癌病人外周血中ctDNA甲基化水平进行检测，结果显示,胰腺癌组ctDNA甲基化基因数量平均为8.41(95%CI:7.62～9.20)，而对照组为4.74(95%CI:4.40～5.08)，两组差异有统计学意义(P<0.001)，诊断胰腺癌的灵敏度为76%、特异度为83%。虽然ctDNA为胰腺癌早期诊断提供了一种可能性，但现有研究也提示，在胰腺癌的早期阶段，由于ctDNA的释放量较低或ctDNA的浓度太低被降解，导致KRAS突变检测对于胰腺癌早期诊断价值似乎有限，如在70%～80%局部进展期和转移性病人中可检测到ctDNA中的KRAS突变，而对于可切除病人则为30%～68%[31]。同时，由于胰腺癌组织的特殊性，原发肿瘤中KRAS突变检测结果与ctDNA中的KRAS突变检测结果的一致性仍不稳定，为25%～75%[4,46]。因而，需要更敏感的核酸处理和分析技术，以及统一的检测方法和评价标准。

3.外泌体与胰腺癌早期诊断：外泌体因含有丰富的蛋白质及核酸等，是胰腺癌早期诊断方面潜在的重要液态活检标志物，如Melo等[47]于2015年通过对146例胰腺癌病人、32例胰腺良性疾病及120例健康对照人的循环血外泌体表面标志物进行检测分析发现，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(glypican-1,GPC1)蛋白的表达显著升高，对胰腺癌的诊断具有100%的敏感性和特异性，可以早期分辨胰腺癌病人、正常人及胰腺良性疾病病人；Hu等[48]的研究证实，外泌体内GPC1 mRNA的表达对于胰腺癌早期诊断具有重要的意义，可显著区分早期病人和晚期病人，是胰腺癌早期诊断的潜在标志物。然而，后续的相关研究指出，GPC1缺乏可靠的早期诊断能力，如Castillo等[49]报道GPC1在正常胰腺组织和胰腺癌细胞系中都有表达，因此缺乏诊断的价值；Lai等[50]对29例胰腺癌和11例慢性胰腺炎病人的循环血外泌体中的GPC1表达进行检测发现，GPC1不能有效区分胰腺癌和慢性胰腺炎。同时，相关研究亦指出GPC1联合其他外泌体分子标志物的检测可提高诊断效能，如Yang等[51]报道，GPC1联合EGFR、EpCAM、MUC1及WNT2等的诊断灵敏度和特异度可为86%和81%；Lewis等[52]发现，GPC1联合CD63检测的诊断灵敏度为99%，特异度82%。究其原因，可能是由于研究方法、检测对象或实验试剂的差异导致的。因此，仍需要进一步的深入研究GPC1在胰腺癌早期诊断方面的临床应用。此外，有研究报道锌指蛋白4(zinc finger protein-4,ZIP4) 亦是胰腺癌早期诊断潜在的标志物之一[53]。

近来年的研究表明，循环血中外泌体内miRNA在胰腺癌早期诊断方面具有重要的意义，如Que等[54]于2013年对16例胰腺癌、6例慢性胰腺炎、5例胰腺囊性疾病、5例壶腹癌及6例健康对照组人循环血外泌体内miRNA进行检测分析发现，miR-17-5p、miR-21及miR-155等呈差异性表达；Goto等[55]的研究发现，32例胰腺癌循环血中外泌体内miR-21、miR-191及miR-451a等较29例胰腺导管内乳头状黏液肿瘤病人(intraductal papillary mucinous neoplasm,IPMN)和22例健康对照组人表达升高，提示外泌体内异常表达的miRNA是胰腺癌早期诊断的潜在标志物之一。然后，Madhavan等[56]通过对131例胰腺癌病人和64健康对照组人循环血中外泌体内miRNA进行芯片检测分析发现，miR-1246、miR-4644、miR-3976和miR-4306等表达显著升高，联合这4种miRNA的检测，可显著提高胰腺癌的诊断效能，但存在9%的假阳性和20%的假阴性可能。Xu等[57]研究发现，胰腺癌循环血中外泌体内表达升高的miR-196a、miR-196b及miR-1246等，在胰腺癌诊断效能评价中的ROC曲线下面积(AUCs)分别为0.81、0.71和0.73。Lai等[50]对29例胰腺癌和11例慢性胰腺炎病人循环血中外泌体内的检测发现，表达异常的miR-10b、 miR-21、miR-30c、miR-181a及let-7a对胰腺癌诊断的灵敏性及特异性均为100%。综上，以上结果表明,外泌体内miRNA可以作为胰腺癌早期诊断和鉴别诊断的生物标志物，但存在研究方法不统一、实验结果重复性较差及检测样本例数较小等问题，仍需进一步的深入探索。

少数研究也探索了循环血外泌体内DNA(exosomal DNA,exoDNA)在胰腺癌早期诊断中的应用，如Allenson等[58]通过ddPCR系统在样本总量为127例可切除的、局部进展期及转移性胰腺癌循环血外泌体内可检测到KRAS基因突变，其检测率分别为67%、80%和85%，高于外周循环血中的ctDNA KRAS基因突变检测率(分别为46%、31%和58%)；在另一项研究中，Yang等[59]应用ddPCR系统在48例胰腺癌、9例慢性胰腺炎及7例胰腺导管内乳头状黏液瘤病人循环血外泌体内检测到KRAS和TP53基因的突变率分别为40%和4%、55.6%和0、28.6%和14.3%。因此，以上结果提示了exoDNA可能是胰腺癌早期诊断的潜在标志物，然而现有研究表明其在诊断中的作用尚需进一步探索。其一，在健康对照人循环血外泌体内可检测到KRAS突变，突变率可高达3.5%，可出现假阳性结果[60]；其二，目前的研究报道exoDNA在胰腺癌中的诊断效能较差，Allenson等[58]研究报道exoDNA KRAS突变率的诊断灵敏度和特异度分别为64%和85%，Yang等[59]指出exoDNA KRAS突变率的灵敏度和特异度则分别为40%和97%，总体的诊断准确率仅为35%～69%。

液态活检与传统组织活检相比，具有操作简单、不良反应少及经济成本低等特点，不仅减轻了病人的痛苦，且临床应用更为简便。虽然CTCs、ctDNA以及外泌体等检测在胰腺癌早期诊断中的价值较高，但目前尚不足以替代传统检测方法，仍需发展新的检测技术和大规模的临床研究验证。随着液态活检技术的发展和应用，该技术在胰腺癌早期诊断中的应用具有广阔的前景。