钠钾ATP酶与肿瘤研究进展

张叶，李娴静，杨勇

(1.中国药科大学新药安全评价研究中心，江苏 南京 211198；2.中国药科大学基础医学与临床药学学院，江苏 南京 211198)

对钠钾三磷酸腺苷酶(Na+/K+-ATPase)的研究始于1957年，Skou 教授发现 Na+/K+-ATPase是调节离子进出细胞的一种方式，且该酶需要在钠离子和钾离子存在下发挥活性[1]。基于这一发现，Skou 教授荣获了1997年的诺贝尔化学奖。作为一种重要的离子泵，Na+/K+-ATPase最重要的作用就是介导跨膜活性离子的转运[2]。作为 P 型 ATPase家族(也被称为E1-E2 ATPase)的一员，Na+/K+-ATPase能利用 ATP 水解产生的磷酸基团进行 α 基团上天冬氨酸残基的磷酸化和去磷酸化反应，从而将特定离子转运进出细胞[3]。P型 ATPase按照保守序列可分为5个亚家族(PI～V)，其中PII ATP 酶亚家族包括Na+/K+-ATPase，肌浆网 Ca2+泵，胃内H+/K+-ATPase[4]。其中 Na+/K+-ATPase和H+/K+-ATPase是唯一以逆向转运方式起作用的P型ATPase。Na+/K+-ATPase作为主要的膜整合蛋白之一，能同时将3个 Na+泵出细胞并将两个 K+泵入细胞，维持细胞膜内外的钠钾离子浓度差，可调节跨膜电化学梯度，促进膜静息电位的形成，对质膜上其他反应的发生至关重要[5]。

除了广为人知的离子泵的作用外，Na+/K+-ATPase与其他膜蛋白及胞质蛋白的动态相互作用的报道越来越多，这种相互作用在细胞生物活动中至少发挥两种重要作用：①早期研究重点关注的 Na+/K+-ATPase对胞内外离子浓度动态调节，包括 Na+、K+、Ca2+；②通过与信号蛋白的直接相互作用，在细胞信号转导中发挥重要作用，或作为信号整合剂将特定膜组织区域内的影响因子和效应器侨联在一起。过去二十年的研究表明，Na+/K+-ATPase的信号转导功能的改变参与了许多临床疾病如肥胖、高血压、肿瘤等的进展[6]。 Na+/K+-ATPase还被证明作为治疗尿毒症心肌病和组织纤维化的治疗靶标[7-8]。最近研究发现，Na+/K+-ATPase在肿瘤中异常表达，且能通过调节各种与细胞存活和死亡相关途径在肿瘤的发生，增殖和转移中发挥作用[9-13]。强心苷是动植物来源的天然化合物，如洋地黄毒苷、地高辛、毒毛旋花子苷K。强心苷类药物作为 Na+/K+-ATPase的天然抑制剂能抑制 Na+/K+-ATPase的活性。该类药物临床一直用于心力衰竭和心律不齐等心血管类疾病的治疗。但最近研究发现，强心苷通过抑制 Na+/K+-ATPase活性和其他机制发挥抗肿瘤活性，本文对 Na+/K+-ATPase的抗肿瘤作用的研究进展，Na+/K+-ATPase抑制剂(强心苷类药物等)作为肿瘤潜在治疗策略进行了报道。

1 Na+/K+-ATPase的结构和功能特征

Na+/K+-ATPase是由α和β亚基以及属于FXYD(苯丙氨酸-X-酪氨酸-天冬氨酸,简写F-X-Y-D)蛋白家族的调节亚基组成的异源寡聚体。通过分解 ATP 获得能量，进行 Na+、K+逆浓度梯度的主动转运，即能把Na+从细胞内转运到细胞外，把K+从细胞外转运入细胞内，维持细胞膜内外的K+、Na+浓度差以及细胞内外液的渗透压稳定。

α 亚基作为催化亚基由10个跨膜螺旋(M1～M10)组成，这些螺旋上有 Na+和 K+和其他配体的结合位点，包括3个胞质结构域：催化功能域 (A)，核苷酸结合域 (N) 和参与 ATP 水解磷酸化结构域 (P)[14-16]。其中 ATP 分子能与 α 亚基的 N 结构域结合，ATP 发生水解产生的磷酸基团能与 P 结构上的天冬氨酸残基结合[17]。在人类中，Na+/K+-ATPase的 α 亚基有四种不同的亚型：α1、α2、α3 和 α4，分别由α1多肽 (ATP1A1)、α2 多肽(ATP1A2)、α3多肽(ATP1A3)和α4多肽(ATP1A4)的4种不同的基因编码而成[18]。ATP1A1 几乎在所有细胞中均等表达，而 ATP1A2 主要在骨骼、心脏、平滑肌、脑(主要在星形胶质细胞)、肺和脂肪组织中表达。ATP1A3 主要在神经元和心脏中表达。ATP1A4 仅在精子细胞中检测到，对于精子的活动性和男性生育能力至关重要[19]。

β 亚基是一种小型糖蛋白，最初被认为作为分子伴侣发挥作用。Na+/K+-ATPase的 β 亚基不参与任何催化反应，它能与 α 亚基的 M7 和 M10 螺旋相互作用，调节α亚基中的离子运输。β 亚基还可以帮助维持上皮细胞的极化和细胞的运动。抑制 β 亚基功能会导致促进细胞运动的紧密连接丧失，最终导致癌症转移[16]。β 亚基包含3种不同的亚型，分别由β1多肽 (ATP1B1)、β2多肽(ATP1B2)和 β3多肽(ATP1B3)编码得到。ATP1B1 存在于大多数组织中，与α 亚基一起形成组织内最广泛表达的 Na+/K+-ATPase亚型-α1β1复合体。β2存在于神经元，松果体，骨骼肌中，介导神经元与神经胶质细胞的相互作用，促进神经突触生长。β3 在睾丸，肝脏，肺脏，肾脏中表达[20]。

γ亚基又被称为FXYD2，是由66～68个氨基酸组成的小分子多肽。FXYD2 是 FXYD 蛋白家族一员，该家族蛋白被证明可以调节催化亚基的活性。其中 FXYD2 被证明与离子通道的开放有关[21]。此外，还有文献报道 FXYD2 能调节 α 亚基配体的亲和力[22]。尽管 FXYD2 具有某些调节作用，但已发现 Na+/K+-ATPase在没有γ亚基存在下也能正常工作[17]。

如上文所说，Na+/K+-ATPase除了进行 Na+、K+的运输，参与和维持细胞膜内外的电化学梯度外，还能与邻近的膜蛋白相互作用形成信号复合体，进行细胞内的级联信号反应，传递信息。其中NKA/Src/ROS信号通路的激活导致氧化应激失衡，加剧肿瘤、动脉粥样硬化、糖尿病、慢性肾病等疾病发展[23-25]。此外越来越多的证据表明作为一种多功能蛋白，Na+/K+-ATPase在细胞黏附复合物形成和维持中发挥的关键作用。 Na+/K+-ATPase能与许多信号分子和肌动蛋白细胞骨架结合，形成多蛋白复合物，促进细胞间紧密连接和独立连接的形成[26]。有学者解释称在细胞膜上存在两种 Na+/K+-ATPase：一种是作为能量转换离子泵的经典酶池，另一种是局限于小窝的发挥信号传导功能的酶池[27]。在不同的细胞和组织中，这种信号体的组成以及结合的蛋白质可能是不同的，这就导致该信号体在不同组织中尤其是在正常和病理状态下，如癌症中发挥不同功能。

2 Na+/K+-ATPase作为肿瘤治疗的潜在靶点

与相应正常组织相比，在人类癌症中 Na+/K+-ATPase各亚型表达水平发生改变[26]，许多有关 Na+/K+-ATPase促癌作用的报道已证明与 Na+/K+-ATPase的 α 和 β 亚基的差异表达相关，但与 γ 亚基没有关系。如α1亚基在包括非小细胞肺癌[28]、肾细胞癌[29]、胶质细胞瘤[30]和黑色素瘤[31]中表达上调，而 α3 亚基在结肠癌中表达上调[32]。相反的是，α1 亚基据报道在前列腺癌中表达下调[33]，因此，Na+/K+-ATPase的α亚基代表了一些与不良预后相关的癌症类型的潜在新靶点。人 A549 非小细胞肺癌细胞中α1亚基的特异性敲除显著降低了它们的迁移和增殖，进一步表明α1亚基作为这种肿瘤的治疗靶标的潜在用途[28]。此外，β 亚基不仅在 Na+/K+-ATPase本身的调控中发挥重要作用，而且在抑制癌症转移和肿瘤发生的抗肿瘤作用中扮演重要角色，这一点现在被越来越多的人所了解。β 亚基的表达量在肿瘤中也发生了变化，已经有许多报道证实 Na+/K+-ATPase的β1 亚基在人上皮癌细胞中表达下调。Espineda等[34]指出，当肿瘤细胞下调β1 表达时，会显著减少钙粘蛋白表达，这促使肿瘤细胞彼此相互分离，有利于它们的迁移和转移。因此，β1 亚基的下调似乎是许多上皮癌细胞变得独立侵袭的必要条件。此外，有研究报道 β 亚基的表观遗传调控，即 ATP1B1 甲基化下调 β 亚基的表达能促进肾癌细胞的生长，强心苷类药物由于能抑制 Na+/K+-ATPase活性而被证明对癌细胞具有抗增殖作用。

除了已发表文章外，也有许多专利强调了 Na+/K+-ATPase作为未来抗肿瘤靶点的可能性，Rajasekaran报告发现，膀胱癌早期阶段 Na+/K+-ATPase蛋白的总体表达水平较低，随着肿瘤的进展，表达水平会增加。α 亚基高表达和 β 亚基低表达的患者有早期复发的高风险；而具有低表达 α 亚基和高表达 β 亚基的患者具有较长的无复发时间，这表明 Na+/K+-ATPase的 α 和 β 亚基表达水平是膀胱癌患者复发时间的有效预测因子[35]。类似的，研究人员报道，在肾透明细胞癌中β亚基表达降低可能与肾透明细胞癌的侵袭性有关[36]。相比之下，Venta Na Medical Systems发现宫颈组织中 Na+/K+-ATPase β1 亚基表达的增加与宫颈从低度到高度发育不良直到宫颈癌的发病进展相关，可作为宫颈癌发病的生物标志物[37]。总之，Na+/K+-ATPase的表达在大多数癌组织中发生改变似乎是非常明显的，因此可以作为一种有用的新的生物标志物和治疗靶点。

3 Na+/K+-ATPase对肿瘤的促进作用

由于存在结构上的突变以及酶活性的波动，Na+/K+-ATPase参与一些疾病如糖尿病，阿尔茨海默病的发病机制[17]，最近，逐渐有报道发现 Na+/K+-ATPase也参与促进肿瘤生长的部分机制，影响包括上皮间质细胞转化 (EMT)、丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 级联过程、磷酸肌醇3激酶 (PI3K) /蛋白激酶B (Akt) /哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 信号通路、胆固醇稳态等细胞过程和途径。

上皮间质转化是肿瘤发展和侵袭的关键过程，Na+/K+-ATPase的 β 亚基已被证明有助于调节特定细胞上皮极化的完整性，相邻的 β 亚基之间形成二聚体，通过 β - β 桥增强细胞间的黏附。当β亚基的表达增高时，钙黏蛋白(E-cadherin)的活性降低，从而导致 EMT 和癌症的侵袭和转移[38]。

MAPK 家族与细胞周期，增殖凋亡相关，研究发现，强心苷类药物 G 毒毛旋花苷能通过抑制 v-src 禽肉瘤 Na+/K+-ATPase活性活化 p38 MAPK，从而上调 p53 等转录因子的表达[39]，此外，MAPK 信号通路的激活还能促进核因子-κB(NF-κB)表达，从而激发 Fas 介导的细胞凋亡[40]。

PI3K/Akt/mTOR通路参与调节细胞增殖，凋亡和自噬，Barwe等[41]发现PI3K的激活与Na+/K+-ATPase的α亚基的表达增加有关，即调节亚基 p85 结合到 α 亚基上富脯氨酸结构域从而促进PI3K活性上调，从而调节细胞自噬，促进肿瘤细胞存活。

胆固醇也能与催化亚基 - α 亚基结合，两者的相互作用已被证明可以调节胆固醇的运输、合成和代谢。α亚基能与小窝蛋白-1的 N 端结构域相互作用从而调节细胞膜上小窝蛋白-1和胆固醇的含量，钠钾泵表达降低破坏了对质膜上胆固醇运输和合成的调节，Na+/K+-ATPase作为胆固醇代谢调节剂的作用可能是肿瘤生长如乳腺癌的关键因素[42-43]。

此外，也有文献报道抑制 Na+/K+-ATPase后影响细胞钙稳态，从而诱导肿瘤细胞的程序性死亡[44]。在耐药的胶质母细胞瘤细胞中，当 G 毒毛旋花苷上调 ATP1A2 和 ATP1A3 表达时，可使肿瘤细胞对化疗药物敏感，并诱导细胞坏死[45]。

4 Na+/K+-ATPase抑制剂作为新型抗肿瘤药物的临床前研究

4.1 强心苷类药物结构特征 强心苷类化合物包括强心甾和蟾蜍二烯内酯，是一类17位有内酯结构的甾体核结构。由于甾核骨架和17位内酯结构上取代基以及空间立体结构具有多样性，强心苷类药物具有多种类型[46]，其中最广为人知的有地高辛，洋地黄毒苷，G 毒毛旋花苷，夹竹桃苷等。自从1785年Sir William Withering出版《关于毛地黄的记述》开始，临床医生就使用洋地黄制剂来治疗水肿、心律不齐和慢性心力衰竭。强心苷类药物，尤其是洋地黄现在仍广泛用于治疗充血性心力衰竭和心律失常的正性肌力药物[47]。目前人们普遍认为强心苷类药物介导的效应主要是由该类药物与 Na+/K+-ATPase相互作用并抑制 Na+/K+-ATPase活性产生的[48]。

4.2 强心苷类药物的抗肿瘤作用 近些年有关强心苷类药物抗肿瘤作用的报道显著增加，除了对肿瘤细胞有效的抗增殖作用之外，令人感兴趣的是它们在对正常细胞和肿瘤细胞表现出不同的作用。对于正常细胞，强心苷类药物是没有活性的，甚至表现出促增殖作用，但却能选择性诱导肿瘤细胞凋亡[26]。Jiang等[49]发现强心苷蟾毒灵能通过抑制p38 MAPK信号通路在非小细胞肺癌细胞中展示出抗增殖活性。原海葱苷A是另一种强心苷，已被证明可以抑制胶质母细胞瘤增殖和诱导其凋亡，同时提高小鼠的存活率[50]。强心苷还能通过不同机制对乳腺癌的生长具有抑制作用，Kometiani等[51]发现G 毒毛旋花苷通过抑制 Na+/K+-ATPase介导的表皮生长因子受体(Src/EGFR)和 p42/44丝裂原活化蛋白激酶的激活，调节 p21 Cip 介导的通路，导致雌激素受体阴性的人乳腺癌细胞系MDA-MB-435的细胞周期阻滞，抑制细胞生长。

4.3 新型 Na+/K+-ATPase抑制剂的研究进展 除了大量关于新的潜在抗肿瘤强心苷的分离和鉴定的科学文献外，在强心苷结构基础上，设计优化新的 Na+/K+-ATPase抑制剂和配体作为潜在抗肿瘤药物的报道也显著增加。在分析了 Na+/K+-ATPase的结合口袋和具代表性的强心苷药物的结构特点后，有文献确定了导致抗肿瘤活性的关键 Na+/K+-ATPase抑制剂结构特征：需有10位的醛基(-COH)；14位的-羟基(氢键供体基团)，环C和环D的顺式构型；和位于17位的强心甾或蟾蜍二烯内酯基团，这些是 Na+/K+-ATPase抑制剂对肿瘤生长具有高抑制作用所必需的[26，52]。如Lefranc等[53]发现 UNBS1450(一种新型的强心苷类药物)能显著降低胶质瘤细胞内ATP浓度，扰乱肌动蛋白细胞骨架，导致胶质瘤细胞自噬死亡。PBI-05204作为一种夹竹桃苷的结构改造物，在与吉西他滨联合治疗后，不仅降低了夹竹桃苷的细胞毒性作用，还提高了吉西他滨的抗肿瘤活性[54]。

5 讨论与展望

Na+/K+-ATPase作为一种遍布全身的重要酶类，当结构功能发生改变时，会引起肿瘤等疾病。 Na+/K+-ATPase最初被定义为细胞渗透压调节器，但越来越多的研究证明它还能参与细胞内各种信号传导途径并调节它们的功能。近些年来逐渐有报道将其作为治疗癌症的潜在药物靶点。尽管 Na+/K+-ATPase的整体表达被认为是癌症复发潜在风险预测因子，但预测方式具体还是表现在不同亚基的表达水平。如高表达α亚基低表达β亚基被认为是肿瘤复发的高风险因素，低α表达水平高β表达水平的患者肿瘤复发风险低。α亚基作为信号传导元件，能调控影响肿瘤细胞生存和生长多种通路，越来越受到人们的关注。但有关β亚基在肿瘤调控中发挥的作用的研究较少，β 亚基在抑制肿瘤细胞黏附和肿瘤发展中的作用也尚未清楚，未来对β亚基与肿瘤的关系的研究可能会揭示其与不同肿瘤的相关性，进一步揭示 Na+/K+-ATPase在肿瘤进展中发挥的整体作用。

尽管作为天然存在的 Na+/K+-ATPase的抑制剂，强心苷类药物已经被用于治疗心功能不全很长一段时间了，但是它们在肿瘤治疗中的作用也是不可忽视的。了解强心苷在癌症发展和生长过程中的作用可以帮助我们进一步了解如何治疗癌症。最新研究认为强心苷类药物通过改变细胞内外的离子浓度来抑制 Na+/K+-ATPase的功能，也许只是其众多抑制肿瘤生长的机制之一。研究发现，强心苷可通过内源性和外源性途径以及自噬途径触发癌细胞凋亡，可作为另一种抗肿瘤机制。有关强心苷类药物的抗肿瘤活性机制还需进一步研究。迄今为止，关于使用强心苷作为抗癌药物的所有公开临床数据都限于实体瘤。这些临床研究大多样本量较小，并且没有随机对照，因此，数据需进一步证实。系统药理学的方法能在分子和细胞水平上更好地理解强心苷如何杀死肿瘤细胞，这可能有助于确定强心苷干预的主要靶点和信号通路。