DNA甲基化在癫痫演变和进展中的作用

汪智华综述 林志国审校

癫痫是一种常见的神经系统疾病，具有发作性、短暂性、重复性和刻板性的特点。癫痫的发病机制至今不明，对癫痫发病机制的研究可以提高对癫痫的认识，并更好地指导临床诊断和治疗。表观遗传机制是调节基因表达的一种方式，其中DNA甲基化是一种主要的表观遗传修饰。本文就近年来DNA甲基化在癫痫演变和进展中的作用进行综述。

1 DNA甲基化概述

DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（cytosinephosphate-guanine，CpG）二核苷酸的胞嘧啶5'碳位由共价键结合一个甲基基团。DNA甲基化通过DNMT实现。DNMT包括在发育早期阶段负责基因重新甲基化的DNMT-3a、DNMT-3b，以及维持既定甲基化模式的DNMT-1[1]。DNA甲基化位点通常集中在基因的启动子区域内，但也可以在基因的其他位点，可以根据位点和募集的因子促进或抑制基因表达[2]。DNA甲基化改变了DNA的表观和结构，可直接阻碍DNA的识别及与转录因子的结合，或者吸引其他因子优先与DNA结合干扰转录因子的结合，从而使基因的转录抑制或沉默。DNA甲基化是动态的，可通过某些酶的作用对DNA残基中甲基进行修饰或去除[3]。DNA甲基化的可逆性为使用去甲基化制剂治疗人类疾病提供了理论基础。

2 DNA甲基化与癫痫

近年的研究为异常DNA甲基化和癫痫之间的关系提供了一些证据。Belhedi等[4]研究表明在局灶性癫痫和热性惊厥（febrile seizures，FS）中CPA6启动子甲基化增加。动物实验研究发现癫痫持续1 d后，近300个基因出现低甲基化[5]。Li等[6]使用荧光素酶测定和CpG甲基化，发现丙戊酸（valproic acid，VPA）可通过诱导钠通道Scn3a基因启动子-39C位点甲基化，降低启动子活性，产生抗癫痫作用，表明CpG甲基化在癫痫中的重要作用。更有研究表明，DNA甲基化失调是癫痫的原因，而不是癫痫的结果[7]。

3 与癫痫相关常见的基因甲基化

3.1 RASgrf1基因甲基化与癫痫RASgrf1，即Ras-鸟嘌呤核苷酸释放因子1，是一种父系印记基因，其启动子具有差异甲基化区域，可以使基因表达沉默。Chen等[8]使用红藻氨酸（kainate，KA）致痫小鼠的动物模型研究RASgrf1启动子甲基化水平随癫痫进展的动态变化，发现RASgrf1启动子甲基化在急性发作期后逐渐增加，并在潜伏期达到最大值，随后抑制RASgrf1 mRNA和蛋白表达，在慢性期达到最低水平。RG108，一种DNMT抑制剂，可抑制RASgrf1基因甲基化的增加，使RASgrf1基因甲基化在潜伏期被显著抑制，并在慢性期恢复正常表达水平。RG108可能通过调节神经元兴奋性，抑制KA致痫小鼠的急性癫痫发作，而且心室注射RG108干扰潜伏期，可观察到慢性期自发性复发性癫痫发作小鼠数量显著减少，表明RG108可以改变癫痫的进展并防止KA诱导的癫痫小鼠发展成慢性癫痫[9]。这提示对RASgrf1基因甲基化的进一步研究有望阐明癫痫急性发作，急性期向慢性期转变或癫痫复发性特点的机制，并有望发现新的基因治疗靶点，终止癫痫急性发作及其复发。

3.2 青少年肌阵挛性癫痫（juvenile myoclonic epilepsy，JME）相关基因甲基化JME是以肌阵挛、全身强直-阵挛发作、失神发作为特征的遗传性全身性癫痫综合征，占所有癫痫的5%～10%，占特发性全身性癫痫的18%[10]。最近，Santos等[11]借助PRISMA指南对JME遗传关联进行系统评价，认为编码含溴结构域蛋白2（bromodomain-containing protein 2，BRD2）的基因是JME一种重要的致病基因。随后，Pathak等[12]研究表明BRD2基因启动子甲基化与高加索人的JME有关。Schulz等[13]基于相同的JME诊断标准和实验对象招募计划，却得出完全相反的结论，认为目前的研究结果不支持先前研究中强调的BRD2基因是JME的致病基因。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是中枢神经系统的主要抑制性神经递质，使膜电位超极化，降低神经元的兴奋性，有助于维持正常脑功能并防止癫痫发作。研究指出，GABA能系统在介导神经元可塑性以及调节神经元兴奋性方面发挥重要作用[14]。由GABA-A型 受 体（GABA A receptor,GABAAR）活化介导的突触后抑制，通过阳离子-氯化物协同转运蛋白（cation-Cl-cotransporter，CCC）实现，包括钠-钾-氯协同转运蛋白1（NA--K--Clcotransporter 1，NKCC1）和钾-氯协同转运蛋白2（K--Cl-cotransporter 2，KCC2），通过调节细胞内Cl-浓度，维持神经元Cl-稳态，调控神经元功能[15]。最新的研究[16]通过比较JME与健康对照组的DNA甲基化状态，研究NKCC1和KCC2在JME中的潜在作用，结果显示JME病人NKCC1基因甲基化水平显著降低，而KCC2基因甲基化水平显著升高。这提示JME病人NKCC1呈高表达，KCC2则呈低表达。由于NKCC1和KCC2表达失调引起的神经元内外Cl-浓度差，可能弱化GABAAR介导的神经元兴奋性抑制作用，到一定程度后，又可能引起神经元过度兴奋，即从超极化效应向去极化效应的转变，导致癫痫发作。

3.3 RELN基因甲基化与癫痫RELN基因位于7号染色体长臂区域，蛋白产物Reelin在中枢神经系统的发育过程中发挥着重要作用。Reelin是由Cajal-Retzius细胞合成的细胞外基质蛋白，在哺乳动物大脑的早期发育中，可作为神经细胞迁移终止信号调节神经元的迁移和定位，诱导大脑层状结构形成。而在成熟的脑组织中，Reelin蛋白可以调节神经元突触的功能，以及参与大脑层状结构的维持。记忆主要存储在大脑皮层，并与海马结构及脑内化学成分的变化有关。FS是幼儿癫痫发作的最常见类型。Dai等[17]研究发现，RELN基因的高甲基化与FS记忆缺陷有关，并且这种记忆缺陷具有以下特点：①可跨代遗传，幼鼠长时间FS发作可导致成年后记忆缺陷，这种记忆缺陷可由曾在幼年时期经历过长时间FS的母鼠通过基因传递给子代；②可逆转性，DNMT活性是这种记忆缺陷所必需的，DNA甲基化有助于FS诱导的记忆缺陷的跨代传递，DNMT抑制剂可抑制DNMT-1的高表达和RELN基因的高甲基化，并逆转跨代记忆缺陷；③可挽救性，早期丰富环境治疗可以挽救年幼时FS引起的成年期记忆缺陷，由于DNMT抑制剂对婴幼儿有不可预测的副作用，此时环境治疗更能体现出其安全性和有效性。

3.4 脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）基因甲基化与癫痫BDNF是在脑内合成的一种蛋白质，广泛分布于中枢神经系统，对神经细胞有着广泛的营养和保护作用。BDNF能促进苔藓纤维出芽，建立新的突触连接，其高表达能导致癫痫发作[18]。颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）是成人和青少年最常见的难治性癫痫，通常伴有不同程度的记忆障碍，潜在分子机制尚不清楚。研究指出，海马注射BDNF可增加癫痫发作[19]，在记忆形成期间，海马BDNF基因转录受DNA甲基化机制调控[20]，并且BDNF甲基化在癫痫模型海马中受到异常调节[21]。这提示BDNF过表达可能通过增加皮质活动和癫痫易感性而导致记忆缺陷。近期的研究还指出发作间期棘波活动和θ频率振荡是导致癫痫记忆障碍的原因[22]。Parrish等[23]使用KA诱导的TLE小鼠，通过亚硫酸氢盐测序的方法，证实在记忆巩固期BDNF基因甲基化水平降低与癫痫海马异常高水平的BDNF mRNA强烈相关；用甲硫氨酸（Met）补充甲基，可增加BDNF基因甲基化，在记忆巩固过程中降低海马BDNF mRNA的水平；同时，脑电图显示，发作间期棘波活动减少，θ节律能力增加。这表明异常DNA甲基化介导基因转录与TLE相关的记忆缺陷密切相关，通过Met补充甲基可能逆转海马依赖性记忆缺陷。但是Met以何种更安全有效的方式补充以及量的确定仍有待进一步研究。

综上所述，癫痫演变和进展的一个主要假设是基因转录和蛋白质表达的大规模变化导致异常的网络重组和过度兴奋，导致癫痫发作反复发生。DNA甲基化引起的基因转录和蛋白质表达的异常改变，可能在癫痫异常网络形成或重组中起作用，癫痫相关基因甲基化的研究作为一个新的领域具有广泛前景，有助于了解癫痫机制，并根据特定基因位点的甲基化改变定制特定的甲基化调节剂，以抑制或增强癫痫相关基因的甲基化，从而更好地治疗癫痫，使手术作为一个补充应用于极少数药物难治性癫痫。