基于UPLC－QTOF MS的食品接触用回收PET中非挥发性有机物的非靶向筛查

董 犇，吴学峰，郝天英，李 丹，曾 莹，吴思亮，寇筱雪，黎梓城 ，陈 胜 ，3，林勤保 ，3，钟怀宁 ，3*，郑建国 *

（1．广州海关技术中心，国家食品接触材料检测重点实验室（广东），广东 广州 510623；2．暨南大学包装工程研究所，广东普通高校产品包装与物流重点实验室，广东 珠海 519070；3．中国食品接触材料可持续发展工作组，广东 广州 510070）

聚对苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate，PET）具有良好的透气性、光泽度、稳定性和成型性等性能[1]，被广泛应用于食用油、矿泉水、碳酸饮料等多个食品包装领域[2－3]。目前，PET瓶已居塑料食品包装领域之首[4]。但是，PET具有极强的化学惰性，是一种生物不可降解的材料，容易造成严重的环境污染和资源浪费。因此，对PET食品包装的回收利用成为当今国内外解决塑料垃圾，保护生态安全的重大举措，具有巨大发展前景[5－7]。

食品包装用回收PET（rPET）材料的化学物质和污染物比原生PET材料更加复杂[6]。一方面由于有不同种类的化学物质用于食品包装用rPET材料的生产和处理，如生产环节使用的单体、树脂、添加剂、聚合反应助剂等，而在生产过程中，受工艺、温度、时间、辐照等因素的影响，材料和制品中有可能迁移出很多化学物进入食品[8]；另一方面，在PET产品的消费和机械回收再生处理中，可能会引入一些外来污染物，如食物油脂、饮料残留、家庭清洁剂和农药等，这些物质可能残留在rPET中，并最终迁移到食品中[9]；上述这些物质包括杂质、副反应、分解和降解产物以及环境污染物等，国际统称为非有意添加物（NIAS）[10]。而在非有意添加物中，不少物质已被确认为毒性明确或风险较高的高关注污染物，如芳香族伯胺、全氟多氟化合物、环内酯、矿物油[11]等；当含有上述物质的rPET用于食品接触材料时，可能会迁移到食品中，从而威胁消费者的身体健康[12]。欧洲EC NO 282/2008和美国FDA21CFR174．5均规定了从源头开始，rPET必须满足一系列安全指标要求才可用于制造食品包装[6,13]。但国内对食品接触用rPET材料的研究才刚刚起步，本课题组近期发表了对于食品接触用rPET材料中的有意添加物（IAS）和NIAS等物质迁移量的分析检测及安全评估方面的研究[14]。在政府监管层面，由于担心rPET的污染物来源不明而可能导致食品安全风险，目前为止尚未允许rPET用于生产食品接触材料；国内关于rPET中IAS/NIAS分析标准或方法尚未见报道。规范分析技术的缺失导致难于开展食品接触用PET的系统性风险监测和评估工作，因此，亟需开展针对中国rPET材料中IAS/NIAS检测技术的相关研究。

对rPET中检出的NIAS进行准确识别非常困难。许多NIAS物质，特别是非挥发性有机物均无标准物质或未包含在任何可用的数据库中，导致无法准确、高效地鉴定检出物；而软电离（提供母离子信息）和串联高分辨率质谱（提供子结构信息）的使用可为未知物的定性提供丰富的信息。超高效液相色谱−四极杆飞行时间高分辨质谱（UPLC－QTOF MS）兼具上述功能而被视为未知物分析的有力手段，已成功用于食品接触材料中IAS或NIAS的检测[12,15－17]。这也为开展rPET中IAS/NIAS残留物的分析提供了一种新的技术路径和工具。本文使用UPLC－QTOF MS技术对食品接触用rPET制品中的非挥发性有机物进行非靶向筛查和分析。研究结果表明，所建立的方法具有快速、灵敏等优点，在食品接触用rPET中非挥发性污染物的非靶向筛查方面具有十分广泛的应用前景。研究结果可为食品接触用rPET材料的风险评估、标准制修订和风险管理评估工作提供有益参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1290－6546高效液相色谱－串联高分辨飞行时间质谱仪（美国Agilent公司）；ME204电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli－Q超纯水发生器（美国Millipore公司）；AS 7240BT超声波发生器（天津奥特赛恩斯公司）；FM200高速旋转研磨仪（广州市厚普仪器有限公司）。

邻苯二甲酸丁苄酯－D4（BBP－D4）购自Dr．Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇均为色谱纯，购自Fisher公司。六氟异丙醇（纯度>99%，HFIP）购自麦克林公司；测试所需的初步清洗后的瓶片和粒子等PET产品由供应商提供。

1.2 标准溶液的配制

BBP－D4标准品用甲醇配制成质量浓度为1 000 mg/L的单标储备溶液，再用甲醇稀释成质量浓度为10 mg/L的标准中间溶液。

1.3 样品制备及前处理

取适量的原生PET颗粒于高速旋转研磨仪中粉碎成粉末状，用作前处理方法优化的测试样品。

均匀稳定样品的制备：取适量的rPET瓶片于高速旋转研磨仪中粉碎，用作条件优化和测试的样品。

在洁净的玻璃瓶中分别称取0．2～1．0 g待测样品，加入适量的HFIP溶解聚合物，待溶解完全后，加入甲醇并超声1 h使聚合物完全沉淀。随后，将混合物以9 000 r/min离心10 min，取上清液，用1 mL甲醇洗涤离心管壁和残留的沉淀，将所得上清液合并。在温和氮气流或旋转蒸发条件下将上清液吹至近干，并用1 mL甲醇复溶。将复溶后的溶液通过0．22µm滤头过滤，得到待测样品。每种样品设置两个平行，并分析全过程的空白样品。

1.4 UPLC－QTOF MS仪器条件

对于不挥发性物质采用UPLC－QTOF MS在数据依赖型采集（DDA）模式下测试，具体条件如下：流动相：A相：0．1%甲酸水，B相：甲醇；洗脱梯度：0～1．5 min，5%B；1．5～25 min，5%～98%B；25～32 min，98%B；32～32．1 min，98%～5%B；32．1～35 min，5%B；柱温：40℃；进样量：3µL；流速：0．3 mL/min；扫描模式：全一级离子扫描与全二级离子扫描，电离模式为ESI+和ESI−；毛细管电压正模式为4 000 V，负模式为3 500 V；鞘气流速：11 L/min；扫描范围：一级离子：50～1 100m/z；二级离子：20～800m/z；二级离子碰撞能量：10、20、40 eV。

对UPLC－QTOF MS的测试数据，未知化合物通过Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis软件进行分析。通过实验室自建食品接触材料数据库，使用非靶向筛选的方法根据软件的“化合物发现”和“鉴别”功能筛选出候选分子式，并与未知化合物的测试谱图信息进行比较分析。

检出物质的定量通过半定量方法进行。标准品尽可能选择与待定量化合物的物理化学性质相近且不与待定量化合物发生化学反应的物质。本文半定量测试选择邻苯二甲酸丁基苄酯（BBP－D4）和对苯二甲酸作为内标物。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的优化

样品前处理技术在复杂样品的分析过程中起着非常重要的作用，合适的前处理方法可提高痕量目标物在样品中的浓度和消除样品基质对分析的干扰[18]。本文首先通过测试原生PET样品的加标回收率（50µL 10 mg/L的BBP－D4），对样品的前处理方式进行了优化。

2.1.1 沉淀溶剂的选择沉淀溶剂是影响前处理效率的重要因素之一，如产生沉淀过快，则容易包裹待测物质；如产生沉淀较慢或不产生沉淀，则需要消耗大量的溶剂，既增加实验溶剂消耗，也降低了测试效率。实验考察了几种常见溶剂（丙酮、甲醇、正己烷）对BBP－D4加标回收率的影响。结果如表1所示，当用甲醇作沉淀溶剂时，加标回收率最高。这是因为甲醇为沉淀溶剂时，沉淀是颗粒状固体，更有利于待测物质的检出。其余两种溶剂中正己烷产生沉淀的速度较慢，而丙酮产生的沉淀为片状固体。增加或减少溶解溶剂HFIP的量，回收率均会降低，这可能是由于溶剂量较多时，延长了氮吹时间，导致标准物质损失较多；而溶剂量较少时，再沉淀时易包裹标准物质，造成回收率较低。此外，本文也考察了文献方法[19]的实验结果（表1，序号7和8），获得加标回收率为55．0%和64．0%。因此，实验选择甲醇作为沉淀溶剂，溶解溶剂HFIP的用量为10 mL。

表1 不同种类沉淀溶剂及其用量对BBP－D4回收率的影响Table 1 Effects of different types and amounts of precipitation solvents on recoveries of BBP－D4

2.1.2 溶剂去除方式的优化两组平行实验的溶剂分别采用45℃氮吹至近干和45℃水浴加热、旋转蒸发仪去除溶剂至近干两种方式处理后进行测试，BBP－D4的加标回收率分别为66%和46%。但由于旋蒸加热和高真空条件下导致加标物质损失较多。因此，选择45℃氮吹作为溶剂去除方式。

2.1.3 样品量的优化待测样品的用量对非有意添加物的筛查和定性非常重要。样品量过高时，可能会对灵敏度非常高的四极杆飞行时间质谱造成污染；样品量过低时，易造成物质漏检或定性不准。实验考察了待测样品的质量分别为0．2、0．4、1．0 g时对检出物质的影响，结果显示，随着样品量的增加，检出物质的质谱峰强度增加不明显。因此，实验选择0．2 g作为测试样品量。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 测试方法的优化DDA法是高于设定丰度阈值的母离子才会被送到碰撞室中，经高能碰撞产生二级质谱。该方法的优点是其的二级质谱相对比较干净，有利于未知物的准确定性分析；在非数据依赖型采集（Data－independent acquisition，DIA）中，一级质谱中所有离子均会进入碰撞室，经高能碰撞后产生二级质谱，该方法的缺点是一级质谱中所有离子同时产生碎片，导致二级质谱复杂，很难找到母离子和碎片离子的对应关系，不利于未知物的定性分析；MS模式是离子以全通过的模式通过四极杆得到待测物的一级质谱图。实验考察了3种方法对检出物质个数和峰面积的影响，结果表明DDA法检出物质的个数和峰面积之和最优，这主要是由于用于定性的质谱谱库均通过DDA法建立。因此，本文选择DDA法作为测试方法。

2.2.2 流动相的优化UPLC－QTOF MS法常用的流动相是0．1%甲酸水－乙腈或0．1%甲酸水－甲醇体系[19－20]。对未知物的筛查需要同时进行正、负离子模式的电离，而已有文献对于非有意添加物的筛查大多以0．1%甲酸水体系为主[14,19]，因此，本方法水相选择0．1%甲酸水。而对于有机相，实验分别选择甲醇和乙腈进行测试，结果显示使用甲醇为有机相时检出物质数量和峰面积最佳。综上，本方法最终选择0．1%甲酸水－甲醇体系作为最佳流动相。

2.2.3 洗脱梯度的优化合理的洗脱梯度可缩短分离时间，提高分离效果。在选择洗脱梯度时，从水相到有机相的转换速度需合适才能达到较好的分离效果。实验考察了测试时间分别为3、50 min时，5种洗脱梯度对检出物数量和峰面积的影响。结果显示，按“1．4”洗脱梯度时检出物质最多。因此，本方法选择上述梯度进行测试。

2.3 方法学验证

采用样品加标方式来考察方法的精密度和准确度。分别在经相同处理过程的不同空白样品中添加3个不同质量浓度（0．05、0．5、5 mg/L）的BBP－D4。每个加标水平平行测定6次。结果表明，BBP－D4的回收率为66．0%～80．4%，相对标准偏差（RSD）为1．3%～5．1%（见表2）。实验结果表明本方法具有较好的准确度和精密度，满足筛查需求。

2.4 定性分析

在优化条件下，通过UPLC－QTOF MS分析了溶解沉淀处理后的rPET样品中潜在未知物的残留量。共鉴别出含3个有意添加物和27个非有意添加物在内的30种化合物（见表3）。图1显示了rPET样品中潜在未知物的总离子流色谱图。3个有意添加物中，1，2-环己烷二羧酸二异壬基酯和邻苯二甲酸二甲酯[21]是塑料中常用的增塑剂[22]，对苯二甲酸是生产PET的主要原料[1]。27个非有意添加物中，季戊四醇三丙烯酸酯和季戊四醇四丙烯酸酯广泛应用在涂料、油墨、粘合剂、光聚合物反应等领域[23]，可能是回收过程中引入的污染物；棕榈酸乙酯广泛用作香料香精、软化剂、润滑剂[24]，但未见报道在PET生产制备过程中使用；实验检出环状寡聚物10个、线性寡聚物15个，含量范围为0．038～4．92 mg/kg。实验结果表明检出的寡聚物种类比较多，部分寡聚物的含量也相对较高，可能是由于从粒料到瓶子需要经过大约300℃的高温注塑处理，在此高温过程中聚合物可能发生降解所致。此外，研究表明原生PET中也有寡聚物检出[19－20,25]，经过回收再生处理后寡聚物的量和种类是否有明显的增加尚需进一步研究。

表3 rPET样品中鉴定出的化合物Table 3 Identification of screening compounds in rPET samples

（续表3）

图1 样品筛查物质的TIC图Fig．1 TIC chromatograms of screening compounds

2.5 样品主成分分析（PCA）

PCA作为一种无监督的模式识别方法，主要是通过对数据进行降维处理和从整体上直观显示各组样品的差异。为区分不同来源rPET瓶片检出物质的差异，采集不同厂家的rPET瓶片（C组和N组），测试数据通过安捷伦Profinder 10软件进行预处理，结果导入SIMCA14．1软件，选用PCA－X模式进行分析。结果显示，正离子模式下rPET瓶片的C组和N组沿t[1]轴出现了明显分化，表明检出物质差异较大（图2）；而负离子模式下部分样品差异较小。以上结果表明该方法在正离子模式下的检出物可区分不同来源的rPET瓶片。为进一步找出有重要贡献的显著性差异成分，根据变量投影重要性（VIP）>1．2与S－plots图中p（corr）>0．60的标准筛选差异化合物，通过文献检索、数据库匹配及裂解规律，共鉴定出15个显著性差异成分（如表4）。其中介酸酰胺常作为各种塑料、树脂的抗粘剂和滑爽剂[26]；1，3：2，4-二（3，4-二甲基亚苄基）-D-山梨醇作为成核剂广泛应用于各种常见塑料中[27]；磷酸三辛酯作为增塑剂广泛使用于PET等各种塑料加工过程中[28]；其余线型和环状寡聚物12个。根据以上结果，推测不同地域厂家生产的rPET瓶片中寡聚物等物质含量随着所处环境不同而有显著差异。

图2 不同样品在PCA－X模式下的Scores图Fig．2 Scores diagrams of different samples under PCA－X mode

表4 筛选出显著性差异成分列表Table 4 List of significant of difference ingredients

3 结 论

本研究建立了一种UPLC－QTOF MS测定rPET瓶片中非挥发性物质的非靶向筛查方法，优化了不同沉淀溶剂、溶剂去除方式、样品量等前处理条件和流动相、洗脱梯度以及质谱数据采集方法等测试条件，并结合化学计量学分析了检出物化学成分的变化，区分了不同来源的两组rPET瓶片中检出物质的差异。方法前处理简单、灵敏度高、分离能力强，可用于rPET瓶片中非有意添加物的非靶向筛查的相关研究，也可为政府和行业开展食品接触用rPET的再生利用以及安全风险评价提供技术支持。