表面增强拉曼光谱结合主成分分析快速筛查食品接触材料中多环芳烃

葛 琨，何致峰，林佳娜，胡玉玲，李攻科

（中山大学 化学学院，广东 广州 510275）

近年来，由食品接触材料（Food contact materials，FCMs）引起的食品安全问题受到了广泛关注[1－2]。作为FCMs的重要污染物，多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）由于危害大、难降解等特征亟需发展快速分析方法[3－4]。目前，常用的PAHs分析方法包括液相色谱法[5－6]、气相色谱－质谱法[7－8]等，但这些方法所需仪器昂贵，分析过程繁琐，无法满足现场检测和快速筛查的需求。表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）快速、灵敏，具有分子指纹特征，非常适用于FCMs中污染物的快速筛查[9－10]，目前已经应用于多氯联苯[11]、邻苯二甲酸酯类[12－13]、酚类化合物[14－16]、农兽药[17－18]、染料[19－21]等多种污染物的检测。

但是，结构类似化合物的SERS指纹图谱信息往往存在谱峰重叠的问题。为了解决该问题，本课题组建立了薄层色谱结合SERS检测食品接触材料中芳香伯胺的分析方法，得到了较好的结果[22]。另外，也有一些学者利用适配体的特异性识别作用检测环境中的污染物[23－25]，提高选择性。借助数据挖掘技术实现食品接触材料中污染物的快速筛查和污染物鉴别是另一种重要途径，其中，主成分分析（Principal component analysis，PCA）作为数据挖掘的有利工具已经被广泛采用[26－27]。PCA可以对大数据进行降维处理，从而快速提取数据中的有用信息并进行分类。目前，SERS结合PCA已经被用于多目标物如多种疾病标记物的快速检测[28－29]，并取得了较好的结果。

针对食品接触材料中PAHs种类多、结构类似、拉曼信号弱以及拉曼谱峰重叠的问题，本研究利用碘化钾（KI）对纳米银溶胶（Ag nanoparticles，AgNPs）的聚沉效应获得高密度热点，增强PAHs的拉曼信号，并借助数据分析软件SPSS对获取的拉曼谱峰进行PCA分析，考察了PCA在不同条件下的适用性，从而实现了FCMs中4种PAHs（芘、荧蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽）的快速筛查及鉴定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

i－Raman Plus便携式拉曼光谱仪（必达泰克光电科技（上海）有限公司），激发波长为785 nm，光谱测量范围为150～2 800 cm－1；岛津UV－2600紫外－可见分光光度计（日本岛津公司）。

硝酸银（AgNO3）、芘（Pyrene，Pyr）、荧蒽（Fluoranthene，FlA）、苯并[b]荧蒽（Benzo[b]fluorathene，BbF）及苯并[k]荧蒽（Benzo[k]fluorathene，BkF）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水柠檬酸钠（C6H5Na3O7）购自日本TCI化成工业有限公司；碘化钾（KI）购自广州化学试剂厂；上述试剂均为分析纯，实验用水为18．25 MΩ·cm的超纯水。

1.2 AgNPs的制备

本实验所用AgNPs采用文献报道的方法合成[30]：将10．0 mL浓度为10．0 mmol/L的AgNO3加入90．0 mL超纯水中并加热至沸腾，随后快速加入2．0 mL 10．0 g/L的柠檬酸钠溶液，沸腾条件下冷凝回流1 h。待冷却至室温，获得的AgNPs经0．22µm尼龙滤膜过滤后，避光保存于4℃冰箱备用。

1.3 迁移实验

将聚对苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate，PET）和聚丙烯（Polypropylene，PP）2种餐盒裁剪成1 cm×1 cm尺寸，总表面积为150 cm2，置于0．25 L 95%（体积分数）乙醇溶液中，于100℃下保持4 h。整个迁移过程需保持恒温且迁移液不挥发。最后，将迁移液浓缩20倍备用。

1.4 SERS测试

将50µL KI（2．0 mol/L）与200µL PAHs标准溶液或迁移液加入96孔板中，均匀混合后，加入50µL AgNPs，均匀混合15 min后进行SERS测试。SERS测试条件为：激发波长：785 nm；扫描波长范围：200～2 000 cm－1；积分时间：5 s；扫描功率：60 mW。

2 结果与讨论

2.1 SERS测试条件优化

由于本文选择的目标物均属于多环芳烃，在结构和物理化学性质上有许多相似之处，因此选择其中一个目标物可以代表其它目标物。对于溶胶状SERS增强基底，无机盐的加入可以有效降低溶胶体系的稳定性，从而使纳米溶胶发生团聚而产生高密度的SERS热点。因此，本文采用无机盐加入的方法，以0．50 mg/L BbF为目标分子，并记录BbF在687 cm－1处的拉曼强度，考察了SERS测试条件的影响，包括无机盐种类、KI浓度、孵育时间以及KI、BbF和AgNPs的混合体积比例，结果如图1所示。与其它无机盐相比，KI对BbF的增强效果最好，其最佳浓度为2．0 mol/L，最佳孵育时间为 15 min，KI（2．0 mol/L）、BbF（0．50 mg/L）、AgNPs（0．2 nmol/L）的最佳混合体积比例为 1∶4∶1。

图1 BbF的SERS测试条件优化Fig．1 Optimization of determination condition for BbF

在优化条件下，分别比较了不添加KI与添加KI的BbF的SERS图，如图2A所示。在不添加KI的体系中，0．50 mg/L的BbF表现出较差的SERS增强效果；添加KI后，BbF的拉曼信号得到了极大的增强，证明本实验采用的KI体系可用于PAHs的SERS测试。另外，考察了AgNPs、AgNPs+KI、AgNPs+KI+BbF的紫外－可见吸收光谱（图2B），从图中可以看出，AgNPs在418 nm处有明显的吸收峰，加入KI或KI+BbF后，AgNPs在418 nm处的吸收峰消失，即KI的加入可导致AgNPs聚沉从而提高SERS增强效果。

图2 BbF在不同增强基底下的SERS谱图（A）与AgNPs、AgNPs+KI、AgNPs+KI+BbF的紫外－可见吸收光谱（B）Fig．2 SERS spectra of BbF with different substrates（A）and UV－Vis absorption spectra of AgNPs，AgNPs+KI and AgNPs+KI+BbF（B）

2.2 SERS谱峰判定

在最优条件下，对4种多环芳烃进行特征谱峰判定。图3给出了Pyr、FlA、BbF和BkF的谱峰位置，各谱峰具体振动模式见表1。从图3和表1可以看出，4种多环芳烃的拉曼谱峰存在谱峰重叠的现象，例如，Pyr、FlA、BbF和BkF均在1 600 cm－1左右存在苯环的伸缩振动峰；FlA、BbF和BkF在1 447 cm－1左右存在C—C的伸缩振动峰；BbF和BkF均在1 040 cm－1左右存在C—H的弯曲振动峰等。其共有拉曼位移及振动模式见表2。拉曼谱峰的重叠给实际样品中PAHs的快速筛查带来了极大的不便，因此需要有效的数据处理方式实现PAHs的快速鉴别。

图3 4种多环芳烃的SERS图谱Fig．3 SERS spectra of 4 PAHs

表1 4种多环芳烃的拉曼位移及振动模式Table 1 Characteristic Raman peaks and assignment of 4 PAHs

表2 4种多环芳烃的共有拉曼位移及振动模式Table 2 The overlapping of characteristic Raman peaks and assignment of 4 PAHs

2.3 多环芳烃的PCA分析

2.3.1 同浓度多环芳烃的PCA分析为了快速鉴别4种同质量浓度的PAHs（0．50 mg/L），使用PCA对获取的拉曼数据进行分析。首先对采集的4种PAHs的SERS谱峰进行编号，根据拉曼位移的大小排序，每个谱峰对应一个编号，如表3所示，4种PAHs共有28个SERS谱峰。将各PAHs的谱峰标出，按照上述同样的方式进行排序，无特征峰的位置用0代替，获得4种多环芳烃相关谱峰的阵列，将该数据导入SPSS软件进行PCA分析。最终，依据PCA分析结果得到各次SERS测试的主成分因子得分，导入绘图软件后即可观察结果。为了保证数据的有效性，每种多环芳烃采集40个SERS光谱信息，共160个SERS光谱信息，满足样品数：变量数（特征峰数）＞5的要求。PCA结果如表4和图4A所示，从表4中可以看出，160条SERS光谱信息经PCA分析后被提取出3个主成分，其中第一、第二、第三主成分的特征值均大于1，且贡献率分别44．4%、37．1%和18．1%，累计贡献率为99．6%，因此采用该3个主成分进行得分计算并绘图。从图4A中可以看出，4种PAHs经PCA分析后可显著分开，并可判断出各PAHs的位置。上述结果表明，采用PCA分析可以对拉曼谱峰重叠的PAHs进行快速鉴定。

图4 不同PAHs的PCA分析结果Fig．4 PCA analysis results of different PAHs samples

表3 4种多环芳烃拉曼位移的编号信息Table 3 Number information of Raman shifts for 4 PAHs

表4 PAHs总方差分析结果Table 4 Results of total variance analysis for PAHs standards

2.3.2 不同浓度多环芳烃的PCA分析在复杂体系样品中，各个PAHs的浓度很难完全一致，因此考察了PCA对不同浓度PAHs的分离效果。分别采用0．25 mg/L的Pyr，0．75 mg/L的FlA，0．50 mg/L的BbF和1．0 mg/L的BkF进行验证，实验步骤与分析过程与同浓度PAHs相同，具体PCA结果如表4和图4B所示。从表4中可以看出，160条SERS光谱信息经PCA分析后同样被提取出3个主成分，其中第一、第二、第三主成分的特征值分别为14．1、9．2和4．5，且贡献率分别50．4%、33．0%和16．0%，累计贡献率为99．4%，因此该3个主成分被用于主成分得分计算。从图4B中可以看出，4种不同浓度的PAHs经PCA分析后同样可显著分开，并可以明显判断出4种PAHs的位置。上述结果表明，采用PCA分析的方式同样可以对不同浓度的PAHs进行快速鉴定。

2.3.3 多环芳烃混合样品的PCA分析复杂样品体系中，PAHs可能同时存在，因此针对PAHs混合样品进行了PCA分析。具体过程为：采集160份PAHs混合样品的SERS谱图（图5），分别对每份样品SERS谱图中的各特征峰按照大小顺序进行标记，并将160个光谱数据分成4份，每份数据分别用于Pyr、FlA、BbF和BkF的PCA分析。结果如表4和图4C所示，从表4中可以看出，160条拉曼信息经PCA分析后提取出3个主成分，特征值分别为12．3、9．9和5．7，贡献率分别为44．0%、35．2%和20．5%，3个主成分的累计贡献率为99．7%，按照主成分得分进行绘图后（图4C）发现4种PAHs能较好分开，但占据空间大，有误判的风险。因此，在PCA分析的基础上采取最小公差法进一步分析（表4和图4D），同样获得3个主成分，特征值分别为11．9、10．0和6．0，在不改变累计贡献率的基础上，第一、第二、第三主成分贡献率变为42．4%、35．9%和21．4%。第一主成分贡献率下降，第二、第三主成分贡献率上升，从而可以进一步区分4种PAHs。从图4D中可以看出，经最小公差法处理后的PAHs被更好地分离。上述结果表明，PCA分析同样适用于混合样品中PAHs的分析。

图5 一份PAHs混合样品SERS谱图Fig．5 SERS spectrum of a mixed PAHs sample

2.4 食品接触材料中多环芳烃的PCA分析

最后采用PCA对PET和PP 2种FCMs迁移液中的PAHs进行筛查，图6A和图6B分别为PET和PP餐盒迁移液的SERS谱图。根据图3中的SERS谱峰，推测PET餐盒迁移液中可能存在Pyr、FlA，PP餐盒迁移液中存在Pyr、FlA、BkF。分别对PET和PP餐盒迁移液中PAHs的特征峰进行编号，其中PET餐盒共有13个特征峰，PP餐盒共有17个特征峰，因此PET和PP餐盒迁移液共采集90和120条SERS光谱信息。最后，采用“2．3．3”中PAHs混合样品PCA分析策略进行分析。最终PCA结果如表5和图6C、图6D所示。从表5可以看出，PET餐盒的90条拉曼光谱信息经PCA分析后被提取出2个主成分，第一、第二主成分特征值分别为13．8和2．0，贡献率分别为86．0%和12．4%，2个主成分的累计贡献率为98．4%。按照主成分得分进行绘图后（图6C）发现Pyr和FlA被较好地分开。同样，PP餐盒的120条拉曼光谱信息经PCA分析后也提取出2个主成分，第一、第二特征值分别为10．3和7．6，贡献率分别为57．4%和42．1%，2个主成分的累计贡献率为99．5%。按照主成分得分进行绘图后（图6D），发现Pyr、FlA和BkF同样被明显分开。上述结果表明，PCA分析方法可以解决PAHs的拉曼谱峰重叠问题，适用于FCMs中PAHs的快速鉴别。

图6 PET迁移液（A）和PP迁移液（B）的SERS谱图以及PET迁移液（C）和PP迁移液（D）中PAHs的PCA分析结果Fig．6 SERS spectra of PET migration（A），PP migration（B）and PCA analysis results of PET migration（C）and PP migration（D）

表5 FCMs迁移液总方差分析结果Table 5 Results of total variance analysis for migrates of FCMs

3 结 论

本文建立了SERS结合PCA快速筛查食品接触材料中4种多环芳烃（Pyr、FlA、BbF及BkF）的分析方法。利用KI作为絮凝剂使纳米银溶胶聚沉获得高密度热点，以实现4种多环芳烃的表面增强拉曼光谱分析。针对食品接触材料中Pyr、FlA、BbF、BkF 4种多环芳烃拉曼谱峰存在重叠难以鉴定的问题，采用PCA法分别对同一浓度、不同浓度4种多环芳烃以及4种多环芳烃混合样品进行分析。结果表明，4种多环芳烃均可较好地分离、鉴别。将该方法用于食品接触材料中4种多环芳烃的快速筛查及鉴别，取得了较好的效果。该方法的建立对于食品接触材料中多环芳烃的快速筛查具有重要意义。