基于全链条的回收PET材料中非挥发性可迁移物的非靶向筛查及特征风险标志物的确定

杨 颉，马 鑫，杨道远，隋海霞*，杜振霞*

（1．北京化工大学 化学学院，北京 100029；2．国家食品安全风险评估中心，北京 100022）

聚对苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate，PET）因具有出色的阻隔性能而被广泛用于矿泉水瓶、塑料茶包、餐盒餐具及食品包装袋等[1－4]。近年来，塑料制品的一次性使用造成的持久性环境污染问题愈加严重，目前世界各国加强对塑料制品的管控以减少污染，同时通过回收利用使废弃塑料转化为有价值的新产品[5]。PET在自然条件下很难降解，从废弃PET包装材料变为再生PET包装材料包括粉碎、漂洗、烘干、造粒和融熔加工等步骤[6]。回收PET（rPET）是否可再用作食品包装材料有待进一步研究。

研究表明，随着rPET在原材料中添加比例的提高，rPET材料的总迁移量呈线性上升趋势，当rPET添加比例超过50%时总迁移量达到最大值，为原生PET材料总迁移量的5．6倍[7]。rPET中污染物来源为：一是消费后PET制品原先盛装的内容物中水杨酸甲酯等小分子迁移进入PET[8]；二是PET在回收加工过程中引入的污染物以及由材料本身和添加剂降解产生的污染物[9]。

本研究首先采用溶解沉淀法提取碎片、粒料、瓶坯、瓶子4种不同生产阶段rPET产品中的非挥发性小分子潜在迁移物，并根据法规探究rPET瓶子在6种食物模拟液中的迁移情况，结合超高效液相色谱－四极杆飞行时间质谱（UPLC－Q－TOF MS）筛查rPET产品中潜在迁移物及模拟液中迁移物，通过MS－DIAL（Mass spectrometry－data independent analysis software）软件对不同生产阶段的rPET产品进行标志物的快速筛选，确定各个阶段的风险标志物。最后，通过TEST（Toxicity estimation software tool）软件预测潜在迁移物及迁移物的大鼠经口急性毒性、发育毒性和致突变性，使用Toxtree软件对潜在迁移物及迁移物进行Cramer分级，并对潜在迁移物及迁移物进行危害评估。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱－四极杆飞行时间质谱仪（UPLC－Q－TOF MS）：Waters Xevos G2－S QTOF（美国Waters公司），配有 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm ×2．1 mm，1．7µm）；KH－100DE型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；SHA－BA型水浴恒温振荡器（华普达仪器有限公司）；MTN－2800D型氮吹仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；GP225D型电子天平（Sartorius公司）；Milli－Q A10超纯水器（美国Millipore公司）；0．22µm PTFE有机滤膜（津腾公司）。

1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇（HFIP，阿拉丁公司）；甲醇（色谱纯，Fisher Chemical公司）；甲酸（纯度>98%，ACROS公司）；乙醇（分析纯，阿拉丁公司）；乙酸（分析纯，北京化工厂）。超纯水由Milli－Q A10超纯水器制备；基于供应链的碎片、粒料、瓶坯、瓶子4种不同生产阶段的rPET产品由供应商提供。

1.2 色谱与质谱条件

液相色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2．1 mm，1．7µm）；流动相：0．1%甲酸水溶液（A）－甲醇（B）；梯度洗脱条件：0～6 min，97%～0%A；6～10 min，0%A；10～10．5 min，0%～97%A；10．5～12 min，97%A；进样量：1µL；流速：0．3 mL/min；柱温：35℃。

质谱条件：检测模式为MSE；电离模式为ESI+和ESI－；毛细管电压为2．5 kV；锥孔电压为30 kV（ESI+）、40 kV（ESI－）；离子源温度为120℃；脱溶剂气温度为450℃；脱溶剂气流速为1 000 L/h；锥孔气流速为50 L/h；低能通道碰撞能为4 eV；高能通道碰撞能为20～40 eV；扫描范围为m/z50～1 200；采用亮氨酸脑啡肽实时校正质量轴：556．2 766（ESI+），554．2 620（ESI－），每30 s切换1次进行质量数的校正。

1.3 溶解沉淀实验

在玻璃离心管中分别称取0．2 g 4种不同生产阶段的rPET产品，加入2 mL HFIP溶解聚合物。40℃下静置24 h，待聚合物溶解完全，加入4 mL甲醇并超声1 h使聚合物完全沉淀。随后，将混合物以3 000 r/min离心10 min，取上清液，并用1 mL甲醇洗涤残留的聚合物沉淀，合并上清液。在温和氮气流下将上清液吹至近干，并用1 mL甲醇复溶后，经0．22µm PTFE针式滤器过滤，得到待测样品。每种样品设置2个平行，并分析相同程序的空白样品。

1.4 迁移试验

迁移试验参照欧盟No．10/2011[10]及国家标准GB 31604．1－2015法规[11]进行。参考rPET制品的预期用途，选取10%（体积分数，下同）乙醇、3%乙酸、4%乙酸、20%乙醇、50%乙醇及95%乙醇食物模拟物，分别取10 cm2rPET瓶片放入盛有10 mL食物模拟物的玻璃离心管中。根据rPET预期接触的最长时间并利用欧盟推荐的加速实验采用60℃水浴加热10 d作为迁移测试条件。将上述条件下得到的溶液于温和氮气流下吹干，1 mL甲醇复溶后经0．22µm PTFE针式滤器过滤，每个样品设置2个平行，并分析相同流程的空白。

1.5 非靶向筛查流程

使用UNIFI软件对潜在迁移物进行非靶向筛查。UNIFI科学信息系统是沃特世公司开发的一款可对液相色谱与高分辨质谱联用数据进行采集、处理、浏览、报告生成等操作的软件。Q－TOF MSE采集模式能在一次进样下通过低能通道与高能通道分别得到物质的准分子离子峰及碎片信息。通过对比样品与空白的色谱峰及质谱响应，判断物质碎片信息来识别潜在迁移物，未知物的鉴定流程如图1所示。

图1 未知迁移物的鉴定流程Fig．1 Flow chart for identification of unknown migrants

1.6 MS－DIAL标志物筛选

通过MS－DIAL对不同生产阶段的rPET产品进行标志物的快速筛选，以进一步确定各阶段的风险物质。MS－DIAL是一款针对非靶向代谢组学的分析软件，可快速筛选标志物。软件设置如下：根据仪器类型选择数据类型为“Centroid data”，离子模式为正离子。通过ABF Converter软件将液质联用的数据转换为．ABF格式，样品文件批量导入软件中，并设置相应的样品类型、分类ID、分析顺序、进样量（µL）信息。数据收集选项卡设置MS1的容差值为0．01 Da，MS2的容差值为0．05 Da，设置保留时间段为0～10 min，MS1和MS2的质量数分析范围为50～1 200 Da。最大电荷数为2，多线程数为2。为筛选不同生产阶段rPET产品的标志物，设置最小峰高为5 000，峰宽阈值为0．1。使用平滑方法可准确确定峰的左边缘与右边缘，分别设置平滑等级为3，最小峰宽为5。对于正离子模式，选择加合离子为[+H]+、[+Na]+、[+K]+和[+NH4]+。

2 结果与讨论

2.1 rPET瓶中潜在迁移物及迁移物的非靶向筛查

通过UPLC－Q－TOF MS分析了溶解沉淀处理后不同生产阶段的rPET样品及6种食物模拟物迁移样品的潜在迁移物和迁移物。图2显示了不同生产阶段rPET中潜在迁移物的总离子流色谱图。在4种样品及6组迁移实验中共鉴定出包括有意添加物和非有意添加物在内的30种化合物（见表1）。

图2 不同生产阶段rPET中潜在迁移物的色谱图Fig．2 Chromatograms of potential migrants in rPET at different production stages

表1 鉴定的潜在迁移物和迁移物Table 1 Identified migrants and potential migrants

（续表1）

4种不同生产阶段rPET溶解沉淀样品的非靶向筛查结果表明，在碎片、粒料、瓶坯、瓶子中均筛查出PET寡聚体、润滑剂等物质。在瓶坯样品中检出的PET寡聚体种类最多，其次是瓶子和碎片样品，在粒料样品中检测的PET寡聚体种类最少，可能是粒料被加工为瓶坯的过程中产生了新的PET寡聚体（见表1）。通过了解厂商整个rPET的回收加工过程，从粒料到瓶坯需经过300℃左右的高温注塑，因此，推测在此过程中高温导致PET发生降解，从而使瓶胚中的寡聚体种类增加。

润滑剂在聚合物加工中可提高加工速度，降低聚合物与加工机械表面摩擦，减少能耗，提高产品质量。在4种生产阶段的产品中均检出脂肪酸酰胺类润滑剂：硬脂酸酰胺、芥酸酰胺和二十酰胺，均为常见的聚合物润滑剂且均被列入欧盟聚合物添加剂的准许清单[10]。在粒料和瓶胚中检出的9，10-二羟基硬脂酸甲酯也是被欧盟批准使用的一种润滑剂[10]。此外，粒料、瓶坯、瓶子中检测到碎片中未检出的润滑剂十八烯酰胺、十六酰胺及二十烯酰胺，表明在rPET碎片到粒料加工过程中可能添加了润滑剂。

此外，碎片中检出非离子表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚CxH2x+1－O－（CH2CH2O）n－H（x=12，n=2～11；x=14，n=2～9），其用作漂洗剂而在回收清洗过程中被引入。回收PET碎片需去除表面污染物，经过一系列清洗过程后才能用于生产粒料，漂洗剂为清洗阶段的残留。

2.2 MS－DIAL对不同生产阶段rPET产品标志物的快速筛选

采用MS－DIAL对不同生产阶段rPET产品标志物进行快速筛选。样品中所有物质均在散点图中显示，图中点的颜色代表不同色谱峰高度，其中红色为较高色谱峰，蓝色为较低色谱峰。MS－DIAL界面中柱状图为散点图中某一点在各样品中的色谱峰高度。脂肪醇聚氧乙烯醚的鉴定如图3所示，图3中柱状图部分1、2、3、4、5分别代表空白、碎片、粒料、瓶胚、瓶子，保留时间为7．01 min与7．31 min的一系列散点分别为C12H25－O－（CH2CH2O）n－H（n=2～11）、C14H29－O－（CH2CH2O）n－H（n=2～9）。通过对比峰高发现，只有rPET碎片样品存在这两种物质，故这两种物质为碎片样品的标志物。

图3 不同标志物在MS－DIAL中的识别Fig．3 Recognition of different markers in MS－DIAL

限定p值<0．05筛选标志物，定义在所有样品中色谱峰最高或最低为标志物，最终在所有样品中筛选出7个标志物，如表2所示。

表2 确定的标志物Table 2 Identified markers

通过MS－DIAL分析进一步确定了全链条中不同回收生产阶段的风险标志物。碎片中风险标志物为脂肪醇聚氧乙烯醚，而后续阶段筛查中未检出该漂洗剂，其仅在碎片中被发现，说明经历全链条过程后漂洗剂被去除。粒料中风险标志物9，10-二羟基甲基酯硬脂酸为润滑剂，塑料制品加工工艺挤出成型步骤需添加润滑剂。推测在碎片加工为粒料过程中加入了新的润滑剂。瓶坯中风险标志物为PET线性寡聚体，粒料到瓶坯的高温注塑过程中寡聚体为主要风险标志物，可能由于高温加工过程导致PET材料热降解，产生更多的PET寡聚体。综合分析结果，回收PET中最需要关注的风险标志物为PET寡聚体及润滑剂。

2.3 全链条中PET寡聚体及润滑剂的相对含量对比分析

对需要关注的PET寡聚体及润滑剂的相对含量进行对比分析。潜在迁移物及迁移物中大部分为PET寡聚体，包括11种环状寡聚体和7种线性寡聚体。寡聚体的色谱峰面积如图4所示。PET寡聚体结构相似，其在质谱中响应差别较小，因此本文使用PET寡聚体的峰面积表示其相对含量。所有样品中相对含量最高的环状寡聚体为第二系列环状二聚体TPA2－EG－DEG，线性寡聚体为第一系列线性二聚体（TPA－EG）2+H2O。环状寡聚体的相对含量高于线性寡聚体，与文献报道一致，这是由于PET合成过程中在形成环状寡聚体及线性寡聚体之间存在热力学平衡，而小分子量的环状寡聚体更容易生成[12－13]。可以看出在回收PET全链条中，大部分PET寡聚体的相对含量增加，PET回收过程导致PET寡聚体增多。

图4 对全链条不同生产阶段中PET寡聚体的相对含量对比分析Fig．4 Comparative analysis of PET oligomers contents in different production stages in the whole chain

不同生产阶段中润滑剂的相对含量对比分析如图5所示。润滑剂的相对含量从碎片到瓶子的过程中有不同程度的增加。粒料中检出3种碎片样品未检出的润滑剂，推测从碎片到粒料的挤出加工过程中加入了润滑剂，以降低加工时的摩擦力，提高流动性和加工效率。回收加工过程造成PET材料中润滑剂相对含量及种类的增加。

图5 对全链条不同生产阶段中润滑剂的相对含量对比分析Fig．5 Comparative analysis of lubricants contents in dif⁃ferent production stages in the whole chain

2.4 潜在迁移物及迁移物的危害评估

TEST软件是由美国环境保护署开发的毒性评估软件，基于定量结构活性关系（QSAR）原理评估化学品毒性。其包含几种QSAR方法，如分层方法、小组贡献法、单模型方法等，可对已知结构迁移物的急性毒性、发育毒性等不同毒性终点进行预测。使用TEST（v 5．1．1）软件对潜在迁移物及迁移物的LD50、发育毒性和致突变性进行预测，预测方法为共识法，该法是在适用范围内通过对分层方法、单模型方法、小组贡献法和临近值法的预测毒性取平均值得到预测值，对于已有动物试验的迁移物，其LD50值取实验值（见表3）。

表3 潜在迁移物和迁移物的危害评估Table 3 Hazard assessment of potential migrants and migrants

（续表3）

Cramer规则由Cramer等[14]提出，该规则基于化合物毒性与其结构相关的假设，可通过Cramer决策树将化合物分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3类。其中Ⅰ级化合物具有较低的经口毒性，Ⅲ级化合物具有显著毒性，Ⅱ级化合物的毒性则介于两者之间。对不属于DNA反应性致突变物和/或致癌物的潜在迁移物，用Toxtree（v3．1．0）软件对潜在迁移物及迁移物进行Cramer分级，如表3所示。

TEST软件分析发现，所有潜在迁移物和迁移物的致突变性均为阴性，即均不属于DNA反应性致突变物和/或致癌物。而大部分酰胺类润滑剂和PET寡聚体存在发育毒性，可能会对子代发育过程产生不良影响。使用Toxtree软件对潜在迁移物和迁移物进行Cramer分级，PET线性寡聚体均被分为Cramer Ⅰ级，PET环状寡聚体和酰胺类润滑剂均为Cramer Ⅲ级。表明PET环状寡聚体和酰胺类润滑剂的毒性高于PET线性寡聚体，需要重点关注。

3 结 论

本文通过UPLC－Q－TOF MS对回收PET全链条中碎片、粒料、瓶坯、瓶子4种阶段样品进行了非靶向筛查，分析溶解沉淀法得到的不同阶段样品和欧盟及国家标准推荐的6种食物模拟物对rPET瓶进行的迁移测试样品，共提取出30种潜在迁移物和迁移物，主要为PET寡聚体和酰胺类润滑剂。在碎片样品中检出清洁过程引入的漂洗剂，发现在回收加工中高温导致PET寡聚体的增加。利用MS－DIAL进一步确定全链条各个阶段的风险物质，筛选出7种标志物。最后利用TEST和Toxtree软件对迁移物进行危害评估，结果表明部分物质的发育毒性为阳性，PET环状寡聚体和酰胺类润滑剂均为Cramer Ⅲ级物质，需在回收PET全链条生产过程中引起关注。下一步需要结合迁移水平开展暴露评估，并进行最终的风险表征，为rPET是否能够用于生产食品接触材料及制品提供科学依据。