截短型水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E 的原核表达及免疫原性评价

李春明，王丽，马成，刘佳羽，许源航，牟忠梅

1. 长春祈健生物制品有限公司，吉林长春 130012；2. 上海倍谙基生物科技有限公司，上海 200120；3. 赤峰学院附属医院，内蒙古赤峰 024005

水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）是引起水痘和带状疱疹两种疾病的病原体，其基因组大小为125 000 bp，编码67 种蛋白，含12 种糖蛋白，其中糖蛋白E（glycoprotein E，gE）、gB、gH、gI、gC、gL、gK 和gM 研究较为广泛，这些糖蛋白主要分布在病毒囊膜和感染细胞的胞膜上，与病毒的致病性和免疫原性密切相关。

gE 在病毒表面表达较高，含有T、B 细胞表位，是免疫原性和反应原性最强的糖蛋白。有研究采用类病毒颗粒（virus-like particle，VLPs）、昆虫细胞、中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO）等不同表达系统制备了不同长度的gE 蛋白，并对其免疫原性进行了分析，结果表明，gE 具有较强的免疫原性，可作为重组疫苗的候选抗原［1-4］。葛兰素史克公司（GSK）采用CHO 细胞表达了gE 胞外区蛋白，并辅以AS01B 佐剂，制备了带状疱疹疫苗shingrix，临床效果明显优于减毒带状疱疹疫苗，表明抗原的选择和佐剂的使用尤为重要［5-8］。但CHO 细胞表达系统对重组蛋白的表达量较低，且培养周期长，导致产业化生产面临较大困难。原核表达系统是指通过基因克隆技术将外源目的基因插入表达载体，并导入表达菌株，使其在特定原核生物或细胞内表达，常用于生物工程领域，该方法具有成本低、易操作、培养周期短，产量高等优点。因此，本实验通过原核表达系统制备VZV gE 蛋白，并评价其免疫原性，为带状疱疹重组亚单位疫苗的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1. 1 细胞、病毒、菌株及载体 第32 代二倍体细胞（2BS 株）及第48 代VZV 由长春祈健生物制品有限公司研究室保存；感受态E. coli DH5α 及感受态E. coli BL21（DE3）购自北京博迈德生物技术有限公司；载体pET-21b 由国药中生生物技术研究院第一研究室许洪林博士惠赠。

1. 2 主要试剂及仪器 MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver. 3. 0 购自日本TaKaRa 公司；prime STAR HS polymerase DNA 多聚酶、内切酶NdeⅠ、XbaⅠ及EcoRⅠ、T4 DNA 连接酶、质粒提取试剂盒均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；氨苄西林及弗氏佐剂购自美国Sigma 公司；Tryptone、Yeast Extract 购自英国OXiod 公司；HRP 标记的羊抗鼠IgG 购自美国STB 公司；鼠抗gE 单克隆抗体由长春祈健生物制品有限公司研究室制备；IPTG、DTT、Tris、Easy Geno 快速重组克隆试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Ni sepheroseTM6 Fast Flow购自美国GE healthcare 公司。

1. 3 实验动物 SPF 级BALB ／ c 小鼠，雌性，10 只，6 ～8 周龄，体重18 ～22 g，购自长春亿斯实验动物有限公司，动物合格证号为：201600012151。本次实验是以科研为目的，对实验动物的饲养、照料、免疫及处置等均符合动物健康和福利的相关规定。

1.4 引物设计及合成 根据GenBank 中登录的VZVgE 序列（AY016450. 1），截取第25 ～537 位氨基酸对应的核酸序列，经密码子优化，合成含截短型位gE蛋白核酸序列的合成质粒pUC-VZV-gE25-537-His，由金唯智生物技术有限公司（苏州）合成。根据合成质粒pUC-VZV-gE25-537-His 序列，应用Primer Premier 5.0软件设计引物，上游引物：5'-AACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCACAAGTAATCAACACTAACA-3' ；下游引物：5'-AAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGCGCTAACAGAGACAGCACGTTCT-3'（下划线部分为组氨酸标签序列），扩增产物大小为1 560 bp。引物由金维智生物技术有限公司（北京）合成。

1. 5 目的基因的扩增 以合成质粒pUC-VZV-gE25-537-His 为模板进行目的片段的PCR 扩增。PCR 扩增体系为：5×PS buffer 10 μL，模板1 μL，dNTP 4 μL，上、下游引物各1 μL，Prime STAR HS DNA poly-merase 0.5 μL，ddH2O 补足至50 μL。PCR 扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1. 6 重组表达质粒的构建 采用EasyGeno 快速重组克隆试剂盒将PCR 扩增产物克隆至载体pET-21b（经NdeⅠ和EcoRⅠ线性化）中，连接产物转化至感受态E. coli DH5α，加入无抗生素的LB 培养基，于37 ℃振荡培养45 min；转种于含氨苄西林（100 μg ／ mL）的LB 固体琼脂平板上，于37 ℃培养12 ～16 h；挑选单克隆，加入至3 mL 含氨苄西林（100 μg／mL）的LB 培养基中，37 ℃振荡培养12 ～16 h；采用MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver. 3. 0 提取质粒，进行XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定。将阳性克隆送金唯智生物技术有限公司（北京）进行测序，将测序正确的重组表达质粒命名为pET-21b-VZV-gE25-537-His。

1. 7 目的蛋白的表达 将重组表达质粒pET-21b-VZV-gE25-537-His 转化至感受态E. coli BL21（DE3），于37 ℃培养16 ～18 h；挑选单克隆，接种于2 mL含氨苄西林（100 μg ／ mL）的LB 培养基中，37 ℃，220 r ／ min 培养4 h；取培养物，加入IPTG 至终浓度为0. 5 mmol ／ L，继续培养4 h；另取培养物，继续培养4 h。取上述样品各200 μL，10 528 × g 离心1 min，弃上清，进行10% SDS-PAGE 分析。

1. 8 目的蛋白纯化 将表达菌接种至100 mL 含氨苄西林（100 μg／mL）的LB 培养基中，于37 ℃，220 r／min培养4 h；加入IPTG 至终浓度为0.5 mmol／L，继续培养4 h；取培养物，6 700 × g 离心30 min；取沉淀，用20 mL 20 mmol ／ L Tris-HCl（pH 8. 0）重悬，加入DTT至终浓度为1 mmol ／ L，超声破碎3 min，6 738 × g离心30 min；分别取上清和沉淀，进行10%SDS-PAGE分析。取培养物菌体沉淀，加入20 mL 的8 mol／L Urea，室温溶解2 h；6 738×g 离心30 min，取上清，加入1 mL 镍离子层析柱，室温结合1 h；用20 mmol ／ L Tris-HCl + 8 mol ／ L Urea（pH 8. 0）平衡5 个柱体积；依次用含50、100、200、300、500 mmol ／ L 咪唑的20 mmol／L Tris-HCl +8 mol／L Urea（pH 8.0）洗脱，收获洗脱液，进行10% SDS-PAGE 分析。将收获的目的蛋白依次用含4、2、1、0 mol ／ L Urea 的20 mmol ／ L Tris-HCl（pH 8.0）透析。

1. 9 纯化蛋白的Western blot 鉴定 取1 μg 纯化蛋白，经10% SDS-PAGE 分离后，半干法转移至NC膜，用5% 脱脂奶粉于4 ℃封闭过夜；TBST 洗涤3 次，加入鼠抗gE 单克隆抗体（1 ∶1 000 稀释），室温孵育1 h；TBST 洗涤3 次，加入HRP 标记的抗鼠IgG（1 ∶5 000 稀释），室温孵育1 h；TBST 洗涤3 次，加入DAB显色，用水终止反应。

1. 10 动物分组及给药 将纯化蛋白用1 × PBS 稀释至400 μg／mL，按1 ∶1 的比例与弗氏佐剂混合，充分乳化；另将纯化蛋白用1×PBS 稀释至200 μg／mL。分别用两种抗原经背部皮下多点免疫小鼠，100 μL／只，于0、2、4 周免疫1 次，每次免疫后2 周，经尾静脉采血，分离血清。

1. 11 血清抗体效价的检测 用VZV（10 μg ／ mL）包被96 孔板，4 ℃包被过夜；含0. 5% Tween20 的PBS（PBST）洗涤3 次，封闭液（含5% FBS 的PBS）于37 ℃封闭2 h；PBST 洗涤3 次，加入每次免疫后2 周的小鼠血清（1 ∶100 ～1 ∶204 800 稀释），100 μL／孔，37 ℃孵育2 h；PBST 洗涤3 次，加入HRP 标记的羊抗鼠IgG（1 ∶10 000 稀释），37 ℃孵育1 h；PBST 洗涤3 次，加入底物，100 μL ／ 孔，室温反应8 min；加入2 mol ／ L硫酸溶液，50 μL ／ 孔，终止反应，用酶标仪检测A450。

1. 12 血清中和效价的检测 将二倍体细胞（2BS株）接种于6 孔板，2 × 105个／ 孔，37 ℃培养3 ～4 d，细胞生长为致密单层。将第3 次免疫2 周的小鼠血清于56 ℃灭活30 min；用PBS 进行稀释（1 ∶2 ～1 ∶128），将1 000 PFU ／ mL 的VZV 按1 ∶1 的体积比加入至灭活血清，37 ℃水浴孵育60 min；加入6 孔板，100 μL ／ 孔，37 ℃吸附90 min；补加病毒维持液（MEM + 2%胎牛血清+ 1%谷氨酸钠+ 3%碳酸氢钠），3 mL ／ 孔，37 ℃，5% CO2条件下培养7 ～10 d；弃培养液，考马斯亮蓝染液染色5 min，计数噬斑数量，Karbar 法计算50%中和效价。

2 结 果

2. 1 目的片段扩增产物的鉴定 目的基因gE25-537的PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约1 500 bp的目的条带，大小与预期相符，见图1。

图1 目的基因的PCR 产物电泳图Fig. 1 Electrophoritic profile of PCR product of gE25-537 gene

2. 2 重组表达质粒的鉴定 重组表达质粒pET-21b-VZV-gE25-537-His 的双酶切（XbaⅠ／ EcoRⅠ）产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见1 638 bp 的目的基因片段及5 359 bp 的载体片段，大小与预期一致，见图2；测序结果表明，目的基因序列与合成序列（pUC-VZV-gE25-537-His）一致。

图2 重组表达质粒的双酶切（XbaⅠ／ EcoRⅠ）鉴定Fig. 2 Restriction map of recombinant plasmid （Xba Ⅰ／EcoRⅠ）

2. 3 表达产物的鉴定 表达产物经10% SDS-PAGE分析，可见相对分子质量约62 000 的目的蛋白条带，大小与预期相符，见图3；目的蛋白主要以包涵体形式表达，见图4。

图3 表达产物的SDS-PAGE 分析Fig. 3 SDS-PAGE profile of expressed protein

图4 表达产物表达形式的SDS-PAGE 分析Fig. 4 Analysis of form of expressed product by SDS-PAGE

2. 4 纯化产物的鉴定

2. 4. 1 SDS-PAGE 分析 目的蛋白主要在200 ～300 mmol ／ L 咪唑范围内洗脱下来，洗脱产物经10%SDS-PAGE 分析，可见相对分子质量约62 000 的目的蛋白条带，大小与预期相符，纯度达85%以上，蛋白含量为623 μg ／ mL。见图5。

图5 纯化产物的SDS-PAGE 分析Fig. 5 SDS-PAGE profile of purified protein

2. 4. 2 Western blot 分析 纯化目的蛋白可与鼠抗gE 单克隆抗体发生特异性结合，且于相对分子质量约62 000 处可见特异性结合条带，大小与预期一致，见图6。

图6 纯化产物的Western blot 鉴定Fig. 6 Western blotting of purified protein

2. 5 免疫原性分析 两组小鼠随免疫次数的增加，血清抗体水平逐渐增长，3 次免疫后，佐剂组和非佐剂组分别可达1 ∶54 954 和1 ∶25 704，见表1。中和抗体水平分别为1 ∶21. 75 和1 ∶20. 43。

表1 小鼠血清抗体水平Tab. 1 Serum antibody levels of mice

3 讨 论

gE 是VZV 和感染细胞膜表面表达量较高的糖蛋白，具有较强的免疫原性和反应原性，因此对gE 的研究最为广泛，是新一代疫苗的主要候选抗原。葛兰素史克公司研发的带状疱疹疫苗shingrix 的临床效果表明，其免疫效果优于带状疱疹减毒活疫苗，新一代带状疱疹疫苗必将成为研究热点［9-13］。

研究表明，细胞免疫在带状疱疹疾病预防中处于主导地位，抗体水平对该疾病的预防和控制不起主要作用［14-16］；另有研究者认为，细胞免疫的产生与肽链更相关，与糖基化水平相关度较小［17］。因此，采用原核表达系统制备gE 蛋白，作为带状疱疹疫苗的候选抗原是可行的。本研究通过基因重组技术构建了重组表达质粒pET-21b-VZV-gE25-537-His，双酶切鉴定获得的目的基因片段略大，这是由于酶切位点选择差异造成的；原核表达后经10% SDS-PAGE分析，确定其以包涵体形式表达，经镍离子层析柱纯化后，纯度可达85%以上，且可与鼠抗gE 单克隆抗体发生特异性结合。将纯化蛋白与弗氏佐剂混合后，经皮下多点免疫小鼠，免疫3 次后，可产生针对VZV 的抗体，抗体水平可达1 ∶50 000。研究表明，针对gE 的血清和单克隆抗体均具有补体依赖性，不加补体时中和活性较低，加入补体后中和活性大幅提高［18］，本研究制备的血清未加入补体，中和抗体水平可达1 ∶21. 75，与该文献报道相近。

综上所述，本研究原核表达的VZV gE 具有良好的免疫原性，可作为带状疱疹疫苗的候选抗原。今后将进一步以原核表达蛋白为基础，开展相关佐剂研究，并与真核表达相关抗原进行免疫原性比较，进一步评价加入补体的中和抗体水平。