小分子化合物在诱导多能干细胞领域的研究进展

刘鑫洋，秦杰琛 综述，赵庆 审校

1. 昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南昆明 650500；2. 云南中医药大学中药学院，云南昆明 650500

过去人们认为由于细胞发育过程中细胞基因组水平已经发生了变化，因此干细胞经历成熟、分化为普通细胞这一过程被认为是不可逆的。胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）来源于早期发育的胚胎，具有全能性及分化为任何类型细胞的可能，其通过分化为特定的细胞来治疗疾病。但人ESCs 的应用受到伦理学限制，因此直接获取患者体细胞（somatic cells）通过小分子化合物诱导成有分化潜能的多能干细胞成为再生医学的最终目标［1］。2006 年，日本科学家筛选了24 种在小鼠早期胚胎和ESCs 中表达丰富的转录因子，利用逆转录病毒将4 个转录因子Oct-3 ／ 4、Sox2、Klf4 和c-Myc（“山中因子”OSKM）导入分化的体细胞中，得到具有分化潜能和自我更新能力的细胞，命名为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）［2］。iPSCs 的获得不需要ESCs，也避免了核移植、细胞融合等技术带来的伦理问题。iPSCs 来源于自身的成体细胞，无免疫排斥反应，在未来能够成为细胞治疗的理想细胞来源［3］。本文主要针对目前已经报道的小分子化合物的分类、作用以及全化合物诱导获取iPSCs的方法作一综述。

1 细胞重编程及小分子化合物

随着生物科学研究的深入，目前把已经分化明确的细胞重新逆转为具有多能性或全能性的细胞的方式，称为细胞重编程（somatic cell reprogramming）或简称为重编程（reprogramming）。目前，细胞重编程主要通过转染特定的转录因子、细胞核移植、细胞融合来实现［4］。重编程技术的诞生引起了生物医学界的轰动并被广泛研究，但早期研究的细胞重编程涉及逆转录因子的介导，导入基因可能引起插入突变且转换效率极低［5］。近年来研究人员发现了可以替代转录因子的小分子化合物对细胞进行诱导，也可以使已经分化的细胞逆转为具有多能性的细胞。

小分子化合物可自由进出细胞膜，相对分子质量在几十到几百之间，通常由几十个原子组成。目前有研究发现，小分子化合物的主要作用是通过探索基因与操控细胞内基因的表达，来影响细胞内特定的蛋白功能或者对某些蛋白家族的作用位点进行特定的调节，其作用效果通常是可逆的；另外小分子化合物的浓度及作用时间也会影响其对基因和蛋白质的调节［6］。在细胞重编程方面，小分子化合物相对于转录因子的优点还包括其性质更加稳定，购买相对便宜，在实验室使用也比较简单。因此，小分子化合物在干细胞与再生医学领域应用日渐广泛，使用其对诱导iPSCs 起促进作用，从而提高重编程效率或完全替代相关的转录因子，获得更加安全有效的iPSCs。

2 小分子化合物的分类及作用

最早被发现对iPSCs 的诱导起促进作用的化合物为一种组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂丙戊酸（valproicacid，VPA），组蛋白乙酰化可使细胞染色体松散，提高细胞转录活性，易于与外源性转录因子结合，最终提高细胞重编程效率。目前已发现的同属HDAC 抑制剂的小分子化合物还包括苯丁酸钠（sodium phenylbutyrate，SPB）、曲古抑菌素A（trichostatin，TSA）和Butyrate［7-8］。成纤维细胞在重编程过程中会发生间质-上皮转化（mesenchymal-to-epithelial transition，MET），与常见的上皮-间质转换（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）过程刚好相反。MET 过程由外源性重编程转录因子引发，其中TGF-β（transforming growth factor-β）信号通路是MET 所必需的信号通路。目前研究发现，一些TGF-β 信号通路的抑制剂可促进EMT 进程，使重编程的效率提高，已经发现的可促进细胞重编程的TGF-β 信号通路的抑制剂包括repsox（E-616452）、A-83-01、SB431542 和LY-364947［9-10］。有研究者在使人成纤维细胞转分化为多巴胺能神经元细胞的试验中发现，培养基中添加ROCK（Rhokinase）通路激酶抑制剂Y27632、Thiazovivin 及维生素C，可显著提高细胞的重编程效率及存活率［11］。cAMP（cyclic adenosine monophosphate）激活剂forskolin、IBMX、Rolipram 和8-Br-cAMP 也可在细胞新陈代谢上发挥作用，与VPA 结合使用，可促进新生儿成纤维细胞重编程，并提高重编程效率6. 5 倍［12］。此外，人们熟知的Wnt（wingless ／ integrated）信号通路在维持ESCs多能性上也发挥关键作用［13］。GSK（glycogen synthase kinase）-Wnt 信号通路抑制剂CHIR99021、BIO和Kenpaullone 通过抑制糖原合成激酶（GSK-β），促进多能干细胞的自我更新，从而达到提高iPSCs 重编程效率的目的，CHIR99021 也能在仅有Oct4 和Klf4 两个转录因子的情况下，成功将小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）进行重编程［14］。

近年来，通过运用包含了信号通路抑制剂［2i ／LIF（2i：PD0325901）、MAPK（mitogen-activated protein kinase）、ERK（extracellular signal-regulated linase）］-白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）的培养体系来培养猪、小鼠及人多能干细胞，可建立稳定传代的细胞系，其中PD0325901 作为MAPK／ERK信号通路抑制剂的主要作用是维持多能干细胞的多能状态［15-16］。因此，2i ／ LIF 培养体系可维持iPSCs的多能性并使其增殖。也有研究将一种TGF-β 信号通路抑制剂SB431542 加入至上述培养体系中，显著提高了小鼠ESCs 的建系效率［17］。目前发现的小分子还包括一系列组蛋白相关化合物，如组蛋白甲基转移酶（histone methyltransferase）抑制剂（BIX-0129、Hydralazine、AMI-5、Parnate 和DZNep）及组蛋白去甲基化酶（histone demethylase）抑制剂Tranylcypromine［18-19］。还发现一种L 型钙离子通道兴奋剂BayK8644，与BIX-01294 共同作用可提高Oct4 和Klf4 对小鼠成纤维细胞的重编程效率，弥补Sox2 缺失带来的影响［20］。另有研究表明，氧化磷酸化向糖酵解的过渡是iPSCs 重编程的关键步骤，2，6-二磷酸果糖、2，4-二硝基酚、槲皮素等化合物能激活糖酵解抑制线粒体氧化磷酸化，也可提高细胞重编程效率［21-23］。目前已经报道的小分子化合物及其具体分类见表1。

表1 小分子化合物及其具体分类Tab. 1 Small molecule compounds and their classification

3 全化合物诱导iPSCs

在四因子诱导的基础上，添加小分子化合物可提高重编程效率，但由于Klf4 和c-Myc 两个原癌基因的存在，同时用逆转录病毒为载体导入基因可能引起插入突变，使获取iPSCs 这一过程的安全性仍需观察。因此，完全使用小分子化合物替代转录因子从而更加安全地获取iPSCs 就具有了较大的研究价值。通过使用不同化合物的组合，发现VPA、CHIR-99021、Repsox［E-Repsox（E-616452）］和Tranylcypromine 与Oct4 一因子组合可实现重编程，诱导iPSCs的转录因子由最早的4 因子减少为Oct41 因子［29］。又有研究者使用MEFs 细胞、成纤维细胞和脂肪来源干细胞在含10%胎牛血清的DMEM ／ 高糖中培养。经历了3 个试验阶段并且使用了VPA、CHIR-99021、Repsox（E-616452）、Tranylcypromine、Forskolin、TTNPB 和DZNep（VC6TFDT）七种小分子化合物，最终获得了化学诱导的多能干细胞（chemical induced pluripotent stem cells，简称CiPSC）。目标细胞形态特征、基因表达谱、分化能力和嵌合体形成能力均与ESC 相似，重编程的效率达0. 2%。通过小分子化合物组合筛选及优化，仅用其中的4 种小分子CHIR99021、Repsox（E-616452）、Forskolin 和DZNep也能完成体细胞重编程，其中CHIR99021、Repsox（E-616452）和Forskolin 能激活Sall4、Sox2 的表达，而DZNep 能激活Oct4 的表达［24-30］。

研究发现，细胞在化学重编程过程中存在Somatic-XEN-CiPSC 的过程，其过渡态类似于胚外内胚层（extraembryonic endoderm，XEN）细胞，在VC6TFDT 的基础上添加了维甲酸（retinoic acid，RA）受体激动剂AM580 和组蛋白赖氨酸甲基转移酶（histone lysine-specific methyltransferases，KMTs）抑制剂EPZ-004777，使体细胞转变为XEN 细胞，又加入DOT1L抑制剂SGC0946，诱导细胞完成XEN-CiPSC 转化，同时使用PD0325901 和CHIR99021 维持CiPSC 细胞的多能性，最后通过调节小分子化合物的浓度，使小鼠的神经干细胞及小肠上皮细胞诱导成iPSCs［25-31］，在未来通过找到化合物诱导重编程的关键节点，可能更加安全高效地获取iPSCs。有研究表明，生物学诊断试剂5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）通过降低细胞DNA 甲基化水平从而对重编程起到促进作用，其与四因子、三因子或两因子合用能提高诱导效率。Brdu 不但能提高诱导效率，与CHIR99021、Repsox（E-616452）以及与Forskolin 也均能产生iPSCs，获得的iPSCs 在体内外具有自我更新及分化能力，用于试验的小鼠存活长达6 个月，且证实不会导致基因突变［32］。

还有其他研究表明，在低氧条件下，使用三种小分子化合物VPA、CHIR99021 和Repsox（E-616452）可以分别将MEF 细胞、小鼠尾尖成纤维细胞（mouse tail-tip fibroblasts，TTFs）和人尿液细胞（human urinary cells，HUCs）重编程为化学诱导型神经前体细胞（chemical-induced neuralprogenitor cells，ciNPCs），进一步证明了利用Forskolin、Y-27632、JNK（c-Jun N-terminal kinase）抑制剂SP600125 以及PKC（protein kinase C）抑制剂GO6983，在一定程度上直接将正常人或阿尔兹海默病患者的成纤维细胞重编程为化学诱导型神经元细胞（human chemical-induced neuronal cells，hciNs）。这种hciNs 细胞与利用hiPS 细胞诱导获得的神经元细胞在形态、基因表达谱和电生理学特性上一致，且缩短了重编程的时间进程，获得的细胞也更加安全［26-27］。

近年来的研究表明，在VPA、CHIR99021 和Repsox（E-616452）三种化合物的基础上，加入Forskolin 和I-BET151，可将人类成年星形胶质细胞重编程为神经元细胞，这种小分子化合物的组合方式也能诱导人类肝细胞重编程为双能祖细胞［33-35］。2017年，LAI 等［36］使用了SP600125、SB202190、Go6983、Y-27632、PD0325901 和CHIR99021 六种化合物，通过化学混合物的诱导方式从人真皮成纤维细胞中有效地获得化学诱导间充质干细胞，转化率约为38%。同时六种化学物质中有任何一种缺失均会降低重编程效率，且在小分子化合物诱导体系中，重编程时间相对较长和血清使用均可能影响重编程机制。之后又有研究人员使用CHIR99021、PD0325901、SB-431-542、BMP（bone morphogenetic protein）信号通路抑制剂LDN-193189、P53 抑制剂Pifithrin-α 和Forskolin，将人成纤维细胞直接转化为褐色脂肪细胞［28］。在全化合物诱导细胞重编程方面，对于重编程进程或多种化合物组合使用的研究，已经越来越深入和具体，在未来更有利于iPSCs 的临床应用。

4 展 望

自2006 年iPSCs 首次被报道后，化合物诱导细胞重编程已经取得了重大进展。但细胞通过化合物重编程的分子机制目前尚不完全明确，其诱导效率也仍需提高，还需寻找更多小分子组合诱导其他类型细胞重编程。相比传统的基因操作方式，化合物诱导细胞重编程更加方便且安全，随着未来研究的深入，这项技术将在再生医学及相关领域中具有广阔的应用前景，我们期望能早日获得可供临床运用的诱导型细胞。