人参皂苷Rg3对UVB致抑郁模型大鼠行为学的影响

朱 爽， 姜 涛， 张洪长， 韩燕燕， 张 哲， 王恩鹏， 陈长宝

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

抑郁症的特点是思维迟钝、情绪低落、语言行动减少、缺乏活力和食欲不振等。随着工作和生活的步伐加快，人类所受的压力愈来愈大，抑郁症的病发率逐渐上升。根据世界卫生组织预测，抑郁症将列为疾病负担的第二重病，仅次于心脏病[1]。目前公认的致病机制有单胺类神经递质理论、下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)理论、脑源性神经营养因子理论、免疫功能异常理论及氧化应激理论等[2-3]，其中前两种假说已经得到广泛认可，故本研究以两种假说的常用指标5-羟色胺(5-HT)和皮质酮(CORT)作为判定抑郁症的依据。紫外线是皮肤最常接触的刺激源，过量照射产生的高浓度活性氧簇能够引发氧化应激反应，从而导致皮肤损伤、机体免疫抑制、甚至皮肤癌[4]。最新研究表明，中波紫外线(ultraviolet B，UVB)辐射可导致HPA轴活化，降低海马神经新生和突触蛋白表达，并导致受照小鼠产生抑郁行为，而越来越多的证据表明，氧化应激产生的炎症可能是诱发抑郁症的重要因素[5-6]。

人参PanaxginsengC.A.Mey.为五加科植物，是我国珍贵滋补养生中药，人参皂苷是其主要药效成分，是一种固醇类化合物，含量在40.0%左右，主要成分包括人参皂苷Re、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd等，有抗衰老、抗老年痴呆、抗心律失常、抗肿瘤、降血糖血脂、抑制细胞凋亡等功效[7]。通过文献调研发现系统筛选人参皂苷抗抑郁活性成分的研究较少，因此本研究采用体外单胺氧化酶筛选人参中抗抑郁作用单体皂苷，建立UVB辐射抑郁大鼠模型，研究其活性成分对大鼠行为学及生化指标的影响。

1 材料

1.1 动物 40只SD雄性大鼠，体质量(180.0±10.0)g，购自长春生物制品有限公司动物中心，实验动物生产许可证号SCXK-(辽)2018-0001，饲养温度20.0～25.0 ℃，相对湿度50.0%～60.0%，适应性饲养1周，期间饮食自由。

1.2 药物与试剂 单胺氧化酶、氯吉兰、犬尿胺二氢溴酸盐(批号 SLBW9211、MKBW9449V、MKCF5310，美国 Sigma-Aldrich 公司)；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(批号 20170429、20160806，分析纯，北京化工厂有限责任公司)。人参皂苷Rg3、Rb1、Rc、Re、Rf、Rg1、Rh2对照品(纯度大于98%，吉林大学有机化学教研室)；5-HT、CORT酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(批号 DG-050820R、DG-031538R，美国 R&D 公司)。

1.3 仪器 DK600B型保温箱(上海森信仪器有限公司)；TCG16G型涡旋仪(上海安亭科学仪器厂)；Infinite M200PRO酶标仪(瑞士 Tecan 公司)；Eppendorf 5804R高速离心机(德国 Eppendorf 公司)；BT25S天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；-80 ℃超低温冰箱MDF-U54 V[松下医疗器械(上海)有限公司]。

2 方法

2.1 人参皂苷对单胺氧化酶A抑制活性测定 参考文献[8-9]，优化反应条件，确立反应总体积为200 μL。分别向96孔酶标板中加入20 μL样品、30 μL底物和130 μL PBS缓冲液，振荡均匀，于37.0 ℃恒温条件下反应10 min，加入20 μL的单胺氧化酶液(30 U/mL)，振荡均匀，37.0 ℃恒温环境下孵育40 min，立即检测360 nm处的光密度值(OD)，平行试验3次得平均值，即为OD样品，空白孔(不加样品，其他步骤相同)的光密度值为OD空白，背景孔(不加酶试剂和底物，其他步骤相同)的光密度值为OD背景，底物孔(不加酶试剂和样品，其他步骤相同)的光密度值为OD底物。酶的活性范围(OD底物-OD空白)等于ΔOD，最后以下述公式计算抑制率。

2.2 人参皂苷Rg3对单胺氧化酶A抑制活性动力学研究

2.2.1 人参皂苷Rg3对单胺氧化酶A结合可逆性分析 许多抑制剂通过形成一种抑制剂-酶复合物来抑制目标酶的活性，而此过程在含有大量抑制剂环境中会加速进行。为了分析抑制剂与单胺氧化酶A结合的可逆性，可将酶与高浓度抑制剂(人参皂苷Rg3或阳性对照药物氯吉兰)一起孵育，然后对酶-抑制剂复合物进行广泛透析，恢复酶的活性，并分析比较透析前后其活性的变化。将5.0 μmol/mL人参皂苷Rg3与单胺氧化酶A一起孵育，总反应体系1.0 mL，37.0 ℃保温40 min后，测定其在360 nm波长下光密度值。通过在冰上冷却控制反应的终止，样品保持在4 ℃下用PBS缓冲液透析14 h(更换3次)。空白组与阳性对照组进行同样操作，透析前后测定酶活性，判断抑制剂对单胺氧化酶A的抑制活性类型，即可逆性或非可逆性。

2.2.2 人参皂苷Rg3的单胺氧化酶A抑制活性类型 反应体积200 μL不变，固定反应体系中酶溶液的量，改变底物和样品浓度，以底物浓度倒数(1/[S])为X轴、反应速率倒数(1/V)为Y轴，绘制Lineweaver-Burk双倒数曲线，判断人参皂苷Rg3对单胺氧化酶A可逆抑制类型，即竞争抑制、反竞争抑制、非竞争抑制或者是混合抑制。

2.3 人参皂苷Rg3对抑郁大鼠行为学及生化指标的影响

2.3.1 动物模型制备与分组 取雄性SD大鼠40只，体质量(180.0±20.0)g，禁食12 h称定质量，用剃毛器剃除大鼠背部绒毛，间隔2 d剃除1次，实验前随机分为空白组，UVB模型组，人参皂苷Rg3低、高剂量组(40.0、80.0 mg/kg)，每组10只。UVB照射剂量和造模方法与文献[10-11]类似，分别将模型组SD大鼠放于自制的盒子中，使其固定背部朝上，期间禁食禁水。给药组在UVB照射前30 min给予药液，模型组与空白组同时给予生理盐水。UVB辐射时，大鼠背部距离光源30.0～42.0 cm，照射剂量每次366.0 mJ/cm2，持续照射5 d，第6天后，每2 d进行1次辐射，共14 d(10次)，总辐射剂量5.12 J/cm2。收集第14天空白组、UVB模型组及给药组的血清样品，于-80 ℃冰箱保存。

2.3.2 糖水偏好实验 糖水偏好是快感缺失的评价指标。建模前实验动物在安静房间内适应含糖饮水。第1天给予大鼠两瓶1.0%蔗糖水，第2天给予1瓶纯水和1瓶1.0%蔗糖水，并在中间点更换两瓶位置。禁食禁水24 h后，进行动物的基本自来水消耗试验，每只大鼠给予预定量的1.0%蔗糖水和纯水，大鼠自由饮水24 h，并在中间时间更换两瓶位置。24 h后统计大鼠饮水情况。计算糖水偏好率并取平均值。糖水偏好率计算公式如下。

2.3.3 强迫游泳实验 强迫游泳实验反应大鼠的绝望程度。制备圆柱形容器(直径11.0 cm，高25.0 cm)，水深20.0 cm，水温保持在(25.0±1.0)℃。将大鼠放于水中6 min，并记录不动时间，不动标准为大鼠漂浮在水面，身体不挣扎。试验结束后，用毛巾擦干大鼠的毛发，保持体温，清洗漂浮在水面上的粪便。

2.3.4 血清5-HT和皮质酮水平测定 行为学测试后，进行大鼠眼眶取血，取血2.0 mL，在4 ℃血液冷却后3 000 r/min离心10 min，取上清-80 ℃保存，通过ELISA测定5-HT和CORT水平，严格遵循试剂盒说明书。

3 结果

3.1 人参皂苷的单胺氧化酶A抑制活性测定结果 单胺氧化酶是负责单胺神经递质的代谢，影响大脑发育和功能的酶。由图1可知，不同浓度的人参皂苷作用在相同浓度的酶和底物复合物中，人参皂苷Rg3具有较好的释放底物，升高光密度的作用。从图2可以看出，人参皂苷Rg3的IC50值为3.094 μmol/mL，对单胺氧化酶A具有较好的抑制效果。

图1 不同浓度人参皂苷对单胺氧化酶A抑制作用

图2 人参皂苷Rg3对单胺氧化酶A抑制活性结果

3.2 人参皂苷Rg3的单胺氧化酶A抑制活性动力学研究结果

3.2.1 人参皂苷Rg3的单胺氧化酶A结合可逆性分析 采用透析法测定酶-抑制剂复合物的游离度，研究人参皂苷Rg3的结合特性。将高浓度的人参皂苷Rg3与单胺氧化酶A孵育40 min，将酶-抑制剂复合物混合物在4 ℃的缓冲溶液中进行透析，分析透析前后酶的活性(图3)。在没有抑制剂的情况下对单胺氧化酶A进行对照反应，结果显示单胺氧化酶A在透析过程中丧失了约10.0%～15.0%的活性。5.0 μmol/mL的人参皂苷Rg3可以抑制95.0%以上的酶活性，透析后，超过70.0%的酶活性从酶-抑制剂复合物中恢复出来，这表明了人参皂苷Rg3对单胺氧化酶A的抑制是可逆的，形成了可分离的酶抑制剂复合物。而阳性药(氯吉兰)的结果显示了与单胺氧化酶A的可逆性结合。

注：与透析前比较，**P<0.01。

3.2.2 人参皂苷Rg3的单胺氧化酶A可逆抑制活性类型 通过改变底物和样品浓度来研究人参皂苷Rg3对单胺氧化酶的抑制类型，结果(图4)表明，人参皂苷Rg3的系列曲线交于Y轴，随着抑制剂浓度的增加，Km增大，Vmax不变，表明人参皂苷Rg3对单胺氧化酶A的的抑制类型属于竞争性抑制[12-13]。

图4 人参皂苷Rg3的单胺氧化酶A可逆抑制活性类型

3.3 糖水偏好实验结果 如表1所示，辐射第14、21天，与空白组比较，模型组大鼠糖水偏好降低(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，人参皂苷Rg3低、高剂量组大鼠糖水偏好均提高(P<0.05，P<0.01)。

表1 各组大鼠糖水偏好比较

3.4 强迫游泳实验结果 如表2所示，辐射第14、21天，与空白组比较，模型组大鼠不动时间延长(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，人参皂苷Rg3低、高剂量组大鼠不动时间均缩短(P<0.05，P<0.01)。

表2 各组大鼠强迫游泳不动时间比较

3.5 血清5-HT、皮质酮水平测定结果 由表3可知，与空白组比较，模型组大鼠血清5-HT水平降低(P<0.01)，血清皮质酮水平升高(P<0.05)；与模型组比较，人参皂苷Rg3低、高剂量组大鼠血清5-HT水平均升高(P<0.01)，血清皮质酮水平均降低(P<0.05)。

表3 各组大鼠血清5-羟色胺和皮质酮表达的比较

4 讨论

抑郁症是一种以明显而持久的情绪低落为主要特点的综合性常见情感精神性疾病，早在我国古代文献中多有记载，属于中医“郁证”范畴。虽然抑郁症的单胺类神经递质学说是目前较为公认的致病机制，但仍无法完全解释抑郁症的病理生理学机制。近年来，大量研究表明抑郁症的发病率和HPA轴失调之间存在着一定的关系，而过度的应激刺激可能是引发抑郁症的主要因素[14]。UVB辐射可刺激机体产生炎症，并生成大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，引起氧化应激反应。而氧化应激可导致HPA轴活化，通过下丘脑分泌促肾上腺皮质激素释放激素，并刺激促进垂体前叶释放促肾上腺皮质激素，使肾上腺内合成和释放糖皮质激素，使血浆中糖皮质激素含量升高。糖皮质激素可以与海马组织中的特异性受体结合，促进海马神经细胞内立早基因的表达，作用于cAMP反应元件结合蛋白，抑制脑源性神经营养因子的生成，破坏海马的神经可塑性，进而导致抑郁症[15]。本实验采用UVB辐射方法造模，与其他造模方法相比[16]，应激法可较好地模仿临床抑郁患者的症状，且本实验造模方法简单易行、造模时间较短、成本低、实验重复性及可控性较好。综合以上实验结果表明，使用的UVB辐射动物模型基本模拟了抑郁症患者的情绪低落、快感缺乏、思维动作迟钝等抑郁表现和体内单胺类神经递质、HPA轴相关因子代谢异常等变化。

在行为学测试中，快感缺失和易产生绝望情绪反映了动物的抑郁样行为，蔗糖偏好和强迫游泳实验是行为学测试中的常用方法。糖水偏好率是快感缺失的主要指标，有研究指出，糖水饮用量的减少能够反映动物的快感缺乏情况。强迫游泳实验反映了动物在无法逃脱现有环境时的绝望状态，通常以在水中不动时间表示，时间越长，动物越绝望。本研究中，人参皂苷Rg3灌胃可以提高模型大鼠糖水偏好率、缩短强迫游泳不动时间，说明人参皂苷Rg3有明显的抗抑郁效果。在抑郁患者中，HPA轴过度活跃，而皮质酮是HPA轴的重要激素之一，它可以调节人体的代谢、认知和情绪，尤其对焦虑和抑郁作用明显。5-HT是抑郁相关的神经递质，当其水平不足时，会使中脑边缘系统、网状结构和低位脑干的中线区的神经元功能失调，从而出现抑郁症状。本研究中，人参皂苷Rg3治疗可使模型大鼠血清中5-HT水平升高、CORT水平降低，表明人参皂苷Rg3对体内单胺类神经递质和HPA轴具有一定的调节作用，这可能是改善UVB模型大鼠抑郁行为的作用机制之一。

综上，本研究通过体外单胺氧化酶筛选出人参中抗抑郁作用单体皂苷Rg3，采用UVB连续照射建立抑郁动物模型，经行为学观察及神经内分泌物质的检测，证明该模型模拟了抑郁症患者常见行为学表现及血清中5-HT水平降低和皮质酮水平增加等变化。给予人参皂苷Rg3组大鼠糖水偏好率增加、强迫游泳不动时间缩短、5-HT水平增加、皮质酮水平降低，表明人参皂苷Rg3有一定的抗抑郁效果，为继续深入研究其作用机制提供了部分实验依据。