基于质量常数法和化学计量学的黄芪等级评价

司明东， 李新蕊， 李亚楠， 郑玉光,2， 马东来,2*， 李 菁*

(1.河北中医学院 药学院，河北 石家庄 050200；2.河北省中药炮制技术创新中心，河北 石家庄 050091)

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]，始载于《神农本草经》，列为上品，其味甘、性温，有“补气固表之圣药”之称[2-3]。黄芪富含皂苷、多糖、黄酮、氨基酸、亚油酸等多种活性成分，其中黄芪皂苷和黄酮类是主要药理有效成分群，有多种药理作用[4-6]。

黄芪属于药食同源的中药材，随着黄芪有效成分的深入研究，其在临床和保健品市场需求量急剧增加[7]，但黄芪市场质量参差不齐，质量堪忧，如何规范黄芪质量等级评价，促进行业发展成为中药行业研究热点。中药饮片的等级划分能够有效起到中药材优质优价效果，传统“辨状论质”仅通过药材的外观、颜色、霉变情况、虫蛀、色泽等进行等级评价，如《七十六种药材商品规格标准》[8]。除药材本身性状特征外，其内在有效成分也是评价药材质量的关键指标。

本课题组已经利用中药质量常数评价方法完成了种子类药材酸枣仁的等级划分[9]。本次实验对市场或饮片企业收集的28批黄芪药材的直径、厚度和质量进行测量，并利用高效液相色谱检测黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量，通过中药质量常数法建立黄芪药材等级划分标准，同时采用偏最小二乘判别法和主成分分析法等化学计量方法进行验证并筛选出重要特征因子。通过对黄芪药材等级划分研究，有利于规范黄芪药材市场，实现优质优价，使黄芪药材产业健康发展。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；ME204E型电子天平(十万分之一，德国Sartorius公司)；KQ-250DE型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 试剂与药物 黄芪甲苷(批号C14J9Q65734)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号R11O9F71937)对照品均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均大于98.0%。乙腈、甲酸为色谱纯，均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；水为自制超纯水。

28批药材购于安国、亳州中药材市场和饮片企业，编号S1～S24、X1～X4(其中X1～X4为斜切)，具体信息见表1，经河北中医学院郑玉光老师鉴定为正品，标本保存于河北中医学院生药学标本室。

表1 药材信息

2 方法与结果

2.1 指标成分含量测定

2.1.1 黄芪甲苷 参考文献[1]，色谱条件为Thermo Hypersil BDS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈-水(32∶68)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；漂移管温度90 ℃；载气体积流量2.9 L/min；进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 黄芪甲苷HPLC色谱图

精密移取204 μg/mL对照品溶液适量，甲醇稀释至为25、50、75、125、150 μg/mL，在上述色谱条件下进样测定3次。以黄芪甲苷峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为Y=2 955.5X-839.09(r=0.999 9)。

取药材(S1)粉末约4.0 g，精密称定，加甲醇适量，索氏提取法提取4 h后浓缩提取液，加水10 mL，用正丁醇萃取40 mL，共4次，有机层用氨试液40 mL洗涤，共2次，有机层干燥后蒸干，残渣加5 mL水溶解，取上清液，过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5 cm，柱高12 cm)，依次用50 mL纯水、30 mL 40%乙醇、80 mL 70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液蒸干，甲醇溶解并定容于5 mL量瓶中，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。精密吸取20 μL注入液相色谱仪，测定黄芪甲苷含量。

2.1.2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷 参考文献[1]，色谱条件为Thermo Hypersil BDS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.2%甲酸(B)，梯度洗脱(0～20 min，20%～40% A；20～30 min，40%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长260 nm；进样量10 μL。理论塔板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计，应不低于3 000。色谱图见图2。

图2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷HPLC色谱图

精密移取199 μg/mL对照品溶液适量，甲醇稀释至25、50、75、125、150 μg/mL，按上述色谱条件下进样测定3次。以毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)进行回归，得回归方程为Y=7 696.4X+1 799.7(r=0.999 7)。

取药材(S1)粉末约1.0 g，精密称定，精密加入50 mL甲醇，称定质量，水浴回流4 h，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，减压蒸干后甲醇溶解并定容于5 mL量瓶中，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。精密10 μL注入液相色谱仪，测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量。

2.2 形态参数测定 按照随机原则从药材中随机抽取样本，每批300片，分为3组，测定其直径、厚度、质量，并计算平均半径(r)、厚度(h)、质量(m)。

在游戏中，设计了多种游戏场景来考核学生的学习效果，例如：有任务场景、闯关场景、限时场景等。玩家在游戏中，可以自由选择进入某一场景。通过在游戏中回答问题，获得或失去一定分数。在游戏的过程中，如果玩家的分数低于指定的分值时，游戏即判断玩家失败。在游戏中为了提高学习效率，对于玩家回答错误的问题，会继续出现在游戏中，而对于玩家回答正确的问题，则会被游戏屏蔽，而不再出现。以下图2是一次玩家回答问题的图示：

2.4 百分质量常数 将最大质量常数设成100%，其余饮片的百分质量常数计算公式为百分质量常数=(Ax/Amax)×100%，其中Ax为每批药材质量常数，Amax为药材最大质量常数。参考文献[9,11]，以百分质量常数>80%的药材为一等饮片，50%～80%为二等饮片，其余为三等饮片。

3 结果

3.1 指标成分含量

3.1.1 黄芪甲苷 在2015年版《中国药典》规定，黄芪甲苷质量分数不得低于0.040%。在本实验28批药材中，该成分质量分数为0.035 6%～0.110 8%，差异较大，以S21最高，S10、S12、S15不符合药典要求，见表2。

表2 28批药材指标成分含量、形态参数、质量常数测定结果

3.1.2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷 2015年版《中国药典》规定，毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量分数不得低于0.020%。在28批药材中，该成分质量分数为0.020 0%～0.103 4%，均符合药典规定，但差异较大，以S5最高，S7最低，见表2。

3.2 黄芪形态参数 表2、图3显示，28批药材平均直径为1.122～2.394 cm，差异较大，以X2最大，S14最小；平均厚度为0.331～0.438 cm，差异较小，以X1最厚，S13最薄；平均质量为0.184～0.848 g，差异较大，以X1最重，S15最轻。

图3 28批药材形态

3.4 化学计量学 在质量常数方法基础上，采用SIMCA 13.0软件进行系统主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)[13-14]，以药材直径、厚度、质量及黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量为原变量，对28批药材数据进行分析。

图4显示，初始特征值大于1的2个主成分累积贡献率为92.37%，其中第一主成分为82.39%，第二主成分为9.98%，不同等级能较好地区分开。

图4 药材PCA分析图

图5显示，药材被很好地分为3个部分，与图4一致，累积解释能力参数R2X、R2Y分别为0.986、0.874，预测能力参数Q2为0.833，表示模型稳定性和预测能力较好。在0.95的置信区间内，选取VIP值>1.0的成分作为差异性指标，进一步对3个等级药材数据的差异性进行整体分析，结果见表3，可知毛蕊异黄酮葡萄糖、平均直径的VIP值均大于1。

表3 各指标VIP值

图5 药材OPLS-DA分析图

上述结果表明，药材划分等级指标在化学成分和品质上具有一定差异性，也验证了百分质量常数划分黄芪等级的可行性，具体见表4。

表4 28批药材实验前后等级划分比较

4 讨论

传统评价观点认为“黄芪以外皮发白，内心发黄者为佳”，本研究从安国和亳州中药材市场、饮片企业收集的28批黄芪样品均符合传统认识“外皮发白，内心发黄”，但由于其内在黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖含量较低，20批一等品(市场划分等级)中有7批样品按百分照质量常数分级中被列为二等，这可能与黄芪在种植过程中过度“管理”、生长年限、产地加工切制前浸泡过久等有关，野生品和栽培品种也存在一定差异，因而传统药材质量评价仅以黄芪外观的粗细大小来判断其等级是不够科学的。本研究所用中药质量常数等级评价方法是在传统等级划分基础上，结合指标成分含量对药材进行综合性评价，利用黄芪药材的直径、厚度、质量、黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量5个指标建立其百分质量常数等级划分，其中各批次样品间的百分质量常数在19.55%～100%，能够较好分出黄芪药材等级。最终的分级结果显示28批黄芪样品中一、二等药材的平均直径差异不大，三等药材较一等药材直径小了近1倍，整体上分级结果也体现了直径大者(生长年限较长)为佳的观点，提示该方法选取合理，即能够克服主观因素，又能更加科学地体现饮片质量。

为了更科学评价黄芪药材等级划分，本实验在百分质量常数法基础上，利用PCA分析和OPLS-DA分析以上述5个指标为原变量，28批黄芪药材较好地分为3个等级。同时运用OPLS-DA分析表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、平均直径和平均质量可作为黄芩样品等级划分的标记。因此，通过外观特征与有效成分相结合的黄芪等级评价方法，能够有效地杜绝不法商贩把黄芪萃取之后，再烘烤晒干后售卖，保证市场黄芪优质优价，进一步说明质量常数法研究黄芪药材或饮片等级划分的科学性与客观性，保证等级划分的过程全程量化，使等级划分更易操作与应用，实现中药等级划分的科学传承。

综上所述，黄芪药材的中药质量常数分级结果与传统分级方式虽然存在一些差异，但该分级标准即涵盖了传统中药材或饮片评价因素外在形态，又结合了现代评价因素质控指标，可以更加全面、科学地体现药材质量。黄芪药材或饮片进行中药质量常数等级划分，对于有效控制该药材质量具有重要的实用价值，为黄芪市场提供更科学的评价手段。