不同生态环境对冷蒿总黄酮积累的影响

薛 焱， 王同智， 刘欣媛， 高洪波， 薛永志

(1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010110；2.内蒙古煤炭建设生态环境研究院，内蒙古 呼和浩特 010021；3.包头医学院基础医学与法医学院，内蒙古 包头 014040)

蒙药材阿给为菊科蒿属植物冷蒿ArtemisiafrigidaWilld.，别名小白蒿、菟毛蒿，是蒙医常用药，全草入蒙药或中药，中国冷蒿集中分布于内蒙古地区[1-2]。近年来，随着中药材标准化工作深入，为提高药材质量和临床效果，药材道地性研究越来越被关注[3-4]，但对蒙药材的道地性研究甚少。蒙药冷蒿在蒙古族民间有治疗出血疾病的史料记载[5]，牧民取其嫩枝，热水烫后，和玉米面，蒸煮后食用，是一种含有粗蛋白及无氮浸出物的食物[6]。目前，阿给药材来源为野生冷蒿，随着土地日益荒漠化及药材大量开采，冷蒿草原濒于退化。对冷蒿的药学研究主要集中于植物药材质量标准[7]、生药学特征[1]、炮制[8]、化学成分[9-10]及含量测定[11]等方面的研究，而对其有效成分的积累规律研究较少[12]，尤其生态环境对冷蒿有效药用成分积累的影响未见报道。为科学地开发利用冷蒿，本文采集不同生态环境的冷蒿作为实验材料，分析其总黄酮积累与土壤、地理因子的关系，为地道性冷蒿的采集，提供了科学的依据，为冷蒿种质资源筛选及质量评价提供一定的理论参考。

1 材料

1.1 药材和土壤 冷蒿ArtemisiafrigidaWilld.于2017年7月从内蒙古5个地区采集，选择株高相同的地上部分及根际土壤，共100批，经内蒙古医科大学药用植物学教研室鉴定确认为正品，具体信息见表1。

表1 冷蒿采集地及所属生态环境

1.2 仪器与试剂 UV-3010紫外分光光度计(日本日立公司)；BS110S型电子分析天平(德国Startorius公司)；HH-601数显恒温水浴锅(金坛市亮丹实验仪器厂)。所用试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 土壤采集及理化性质测定 有机质含量测定采用重铬酸钾法，土壤pH测定采用电位法，水解性氮采用碱解扩散法测定，速效磷(P)测定采用NaHCO3浸提-钼锑抗比色法，速效钾(K)测定采用NH4OAc浸提-火焰光度法。

2.2 冷蒿总黄酮含量测定 索氏提取法提取冷蒿总黄酮，硝酸铝-亚硝酸钠分光光度法测定含量，其对照品溶液制备、标准曲线绘制、样品溶液制备，以及精密度、重复性、稳定性、加样回收率试验参照文献[12]报道。

2.3 统计学分析 通过SPSS 25.0软件进行处理，对地理、土壤因子与冷蒿总黄酮含量进行简单相关分析，确定简单相关因子，再对其进行偏相关分析，排除各因子之间的相互干扰，确定影响冷蒿黄酮含量主要因子，然后对主要因子进行通径分析和回归分析，计算影响黄酮含量的主要因子系数及影响程度。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 土壤理化性质 表2显示，5个地区之间土壤理化性质均存在显著差异(P<0.05)，其中除pH外，呼伦贝尔市额尔古纳产药材各项指标均高于其他地区，土壤营养丰富；锡林郭勒盟正蓝旗产药材各项指标均低于其他地区，土壤相对贫瘠。

表2 各地区土壤理化性质

3.2 总黄酮含量 按“2.2”项下方法测定，发现吸光度在503 nm波长处敏感，回归方程在0～96.8 μg/mL范围内呈良好的线性关系(r=0.999 4)，精密度、重复性、稳定性、加样回收率试验均符合相关要求。表3、图1显示，不同地区药材总黄酮含量存在显著差异(P<0.05)，以乌兰察布市四子王旗(荒漠草原)和锡林郭勒盟正蓝旗(沙地)较高，锡林郭勒盟锡林浩特市(典型草原)次之，呼伦贝尔市海拉尔区(草甸草原)、呼伦贝尔市额尔古纳(森林草原)较低。

注：不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表3 不同地区冷蒿总黄酮含量比较

3.3 地理、土壤因子与总黄酮含量的简单相关分析 表4显示，总黄酮含量与年均气温、海拔呈极显著正相关关系(P<0.01)，与经度、纬度、有机质和速效K呈显著负相关关系(P<0.05)，而与水解性N和速效P无相关性(P>0.05)；年均气温与海拔呈显著正相关(P<0.05)，与经度、纬度、有机质和速效K呈显著负相关(P<0.05)；海拔与经度、纬度呈负相关(P<0.05)；有机质与水解性N呈极显著正相关(P<0.01)，与速效P呈显著正相关(P<0.05)；速效P和速效K呈显著正相关(P<0.05)。但上述相关关系不能真正反映生态环境因子对冷蒿总黄酮含量的影响及各因子之间的相互作用，为排除各因子相互干扰，须进行偏相关分析。

表4 地理、土壤因子与总黄酮含量的简单相关分析结果

3.4 地理、土壤因子与总黄酮含量的偏相关分析 在“3.3”项下结果基础上，剔除相关性较差的土壤pH、水解性N、速效P，通过SPSS 25.0软件中的Partial分析程序对其他因子与总黄酮含量进行偏相关分析。

一阶偏相关分析结果表明，无论控制哪几个因子，相关系数r均大于0.95，年均气温与总黄酮含量之间的偏相关系数达到极显著水平(P<0.01)，呈正相关性；纬度、速效K与总黄酮含量之间的偏相关性达到显著水平(P<0.05)，呈负相关性；海拔、经度、有机质对总黄酮积累无明显影响(P>0.05)。

3.5 地理、土壤因子与总黄酮含量的多元回归分析及通径分析 将年均气温、纬度、速效K作为自变量，分别用X1、X2、X3表示；总黄酮含量作为因变量，用Y表示，进行多元回归分析，得方程为Y=6.067+0.625X1-0.461X2-0.324X3，P=0.000 31，可知年均气温与总黄酮含量存在正相关关系，前者每增加1个单位，后者平均增加0.625；纬度与总黄酮含量存在负相关关系，前者每增加1个单位，后者平均降低0.461；速效K与总黄酮含量存在负相关关系，前者每增加1个单位，后者平均降低0.324。

由通径分析可知，年均气温、纬度、速效K对总黄酮含量直接影响作用的通径系数分别为r1y=0.734，r2y=-0.242，r3y=-0.255。显著性检验结果表明，上述3个因素通径系数的显著性均小于0.05，即对总黄酮含量均有显著影响。图2显示，年均气温对总黄酮积累的影响是正向的；纬度、速效K对总黄酮积累的影响是负向的；纬度对年均气温、速效K也存在负向影响。这符合内蒙古纬度越高，年均气温越低的基本事实，并且也可解释为纬度通过影响年均气温来影响总黄酮含量，纬度与速效K分布呈负相关现象，即内蒙古高纬度高地区速效K含量偏低。

图2 年均气温(X1)、纬度(X2)、速效K(X3)对总黄酮含量(Y)的通径分析

4 讨论

4.1 冷蒿总黄酮积累与土壤营养 冷蒿总黄酮含量并未随土壤肥力的增高而增加(图1、表4)，土壤营养丰富的额尔古纳地区冷蒿总黄酮含量并不是最高的，反而内蒙古西部的四子王旗含量却是最高的，这说明土壤贫瘠的内蒙古西部草原可能是药用冷蒿的最佳产地。2004年，Yan等[13]研究表明药用品质较高的野生红景天分布于土壤速效P较为缺乏的地区，这与本研究有相同之处。但与卢丽兰[14]研究认为土壤营养越好对药材广藿香药用成分积累越有利正好相反，分析其原因可能是因为卢丽兰的研究是基于室内控制实验，设置不同水肥条件情况下，施肥对药用成分的影响，而本研究是基于自然环境下，天然冷蒿的药用成分与土壤营养的关系。由此可见，水、肥、温度均有利的室内控制实验与自然条件下药用植物的有效成分的积累机制是有区别的，也有可能是广藿香与冷蒿的物种差异造成的，究竟是何原因造成高总黄酮含量的冷蒿分布于相对营养缺乏的四子王旗草原，还需要下一步采取异地移植栽培实验的方法进一步研究。

土壤中速效K对冷蒿总黄酮含量积累有负向作用(图2)，岳聪慧等[15]研究也表明不同栽培区土壤中磷、钾以及有机质不同，附子品种间双酯型生物碱以及总碱含量差异明显。内蒙古地区钾元素分布是由西到东钾元素含量逐渐递减，冷蒿总黄酮含量逆钾元素分布梯度分布[16]，实验分析结论与自然背景数据是吻合的，间接印证了冷蒿总黄酮积累对钾元素是敏感的，需要在以后的研究中进行精准室内试验加以进一步验证。

4.2 高品质冷蒿药材的最佳分布地 通径分析图2可知，年均温度对冷蒿总黄酮的积累贡献最大，四子王旗恰恰是纬度最低、年均温度最高的地区，冷蒿能够适应该地区贫瘠土壤，并在温度较高的温带四子王旗草原完成药用成分的积累，其合成和积累不仅与植物的基因型有关，与生态环境和土壤也有着密不可分的联系，生态环境条件变化将引起次生代谢产物含量的变化[16-20]。不同生长环境经纬度、光照的强度、温度、空气湿度等生态因子不同对药用成分含量的累积影响较大[21]。已有的研究显示黄花蒿[21]、黄芩[22]和紫苏籽[23]中多数次生代谢产物与纬度成负相关，而与温度成正相关等现象，本研究也显示冷蒿总黄酮含量与纬度成负相关，而与年均气温成正相关，这些研究都表明药用植物有效成分对于能量的需求是趋同性，阳光充足、温度较高的低纬度地区对有效成分积累有积极作用。高纬度环境不利于冷蒿总黄酮的积累，纬度越高，太阳高度角越低，太阳的辐射能量越低，冷蒿种群接受的光、热越少[24]，冷蒿次生代谢物的总黄酮合成越少，年均气温对冷蒿总黄酮含量影响也有类似之处。综上所述，冷蒿的适宜生态环境为年均气温高、纬度低和速效K含量低的荒漠草原(乌兰察布市四子王旗)。