POPDC2在肺癌中的功能探究

梁积峰，温 瑶，杨博宇，林 礼，范雄伟*，张 凯，李 芳*

(1.湖南师范大学心脏发育研究中心，省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室，动物多肽药物创制国家地方联合工程实验室，中国 长沙 410081；2.中南大学湘雅医院老年病科，国家老年疾病临床研究中心，中国 长沙 410008)

目前全世界每年有180万～800万的人被确诊为肺癌，其中死亡人数高达160万～600万。因环境、医疗等地区差异，肺癌的5年生存率约为4%～17%[1,2]。在中国，所有癌症中肺癌的发病率和致死率均位于第一，肺癌死亡成为我国仅次于中风、缺血性心脏病的第三大致死性疾病。肺癌发病机制未知，大量研究表明长期吸烟、在污染的空气中呼吸和遗传易感性等诱因协同导致肺癌发生[3]。

由于不同类型肺癌亚群或克隆在肿瘤内的异质性，肺癌的治疗面临巨大挑战。新诱导因子和抑制因子的鉴定以及对肺癌病因学的深入了解，是发展有效的肺癌治疗方法的关键。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)信号途径是生物体内重要的信号转导途径之一，参与细胞的基因表达调控和细胞质功能调控等过程[4,5]。通路中关键基因应激活化蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)[6]以及和JNK类似的应激活化蛋白基因P38等异常激活或抑制都会诱导细胞自噬或凋亡[7]，并与多种肿瘤的发生有关[8]。细胞凋亡是维持生物内环境稳定的一种重要生理机制，涉及多基因的激活、表达及调控，而细胞凋亡的抑制以及自噬的失衡是肿瘤发生的重要的细胞学基础。自噬是另一种启动细胞程序性死亡的方式，与凋亡共同调控细胞生存和死亡[9]。抑癌基因p53的激活将导致细胞凋亡增加[10]。自噬相关蛋白beclin1和LC3A/B作为自噬特异性标记分子，介导细胞自噬进而影响凋亡[11]。

Popeye结构域(Popeye domain containing, POPDC)基因家族由POPDC1，POPDC2和POPDC3组成。POPDC基因家族编码一类含有3个跨膜螺旋结构域和一个进化保守的细胞质popeye结构域的新型环磷酸腺苷 (Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)效应蛋白[12]。在小鼠和斑马鱼中进行的功能缺失实验证实POPDC家族在骨骼肌再生、心律控制和应激信号传导方面起重要作用[13]。最近几年，POPDC家族在癌症中的作用研究也取得了一定进展。乳腺癌中，POPDC1通过抑制表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制癌症的发展[14]。在肺癌中，POPDC1的甲基化程度显著增加[15]。在胃癌中，POPDC3的低表达预示着较低的生存率[16]。然而POPDC2是否参与了肺癌的发生，在临床样本中POPDC2是否存在差异性表达以及POPDC2在肺癌中的细胞学功能，尚不清楚。

本研究试图分析POPDC2在肺癌组织中的表达情况，在A549细胞中过表达POPDC2，检测其对细胞凋亡水平、相关凋亡基因和MAPK信号通路关键基因表达的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 A549(人类肺腺癌肺泡基底上皮细胞)细胞系，从湖南师范大学生命科学学院心脏发育研究中心获得。

1.1.2 试剂和实验材料 pCMV-Tag2B-POPDC2质粒从湖南师范大学生命科学学院心脏发育研究中心获得；1640细胞培养基和FBS购自thermo fisher生物公司；RIPA蛋白裂解液，蛋白酶抑制剂，磷酸化酶抑制剂，蛋白印迹膜再生液/抗体剥离液以及5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液购自康为生物有限公司；POPDC2抗体，p53抗体、beclin-1抗体、LC3A/B抗体，P38抗体、p-P38抗体、JNK抗体、p-JNK抗体，β-actin抗体、GAPDH抗体、鼠二抗和兔二抗均购自abcam生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌患者的80%，最常见的类型为肺腺癌(Lung adenocarcinoma，LUAD)和肺鳞状细胞癌(Pulmonary squamous cell carcinoma，LUSC)。使用TCGA数据库(链接http://gepia2.cancer-pku.cn/#analysis)实时分析LUAD和LUSC癌组织与正常组织的各基因表达情况。

1.2.2 A549细胞转染 步骤如下：培养80%融合度的A549细胞；将10 μL过表达POPDC2质粒与100 μL转染稀释液混匀振荡离心，静置5 min；再与加入10 μL Lipo 2000的100 μL稀释液混匀振荡离心；静置20 min，随后将混合液加入A549细胞中。

1.2.3 流式细胞术检测 步骤：1)收集细胞3 000 r·min-1离心5 min，弃去上清；2)使用PBS漂洗2次，弃去上清；3)加入提前预冷好的PBS 1 mL，乙醇2.5 mL，4 ℃固定过夜；4)3 000 r·min-1离心5 min，弃去上清；5)用PBS漂洗2次，弃去上清，随后加入1 mL PBS，再加入终浓度为50 g·L-1的RNase A；6)每隔5 min摇晃一次，37 ℃消化30 min；7)放在冰盒上终止消化；8)过一次38 μm的尼龙筛放入流式上样管中；9)加入50 μL含1% Triton的PI，室温避光染色5 min。

1.2.4 细胞总蛋白提取 吸弃1640培养基后，用PBS漂洗3次；用细胞刮将细胞刮下，收集到一个1.5 mL的离心管中，加入适量裂解液，封上封口膜，用细胞超声破碎仪破碎20次，每次5 s，间隔5 s，随后冰上裂解15 min；再按照说明书加入终浓度为1×的SDS蛋白上样缓冲液，用漩涡震荡机混匀之后放入沸水浴10 min，然后12 000 r·min-1离心10 min取上清，分管冻存在-80 ℃。

1.2.5 免疫印迹(Western Blot)分析 先根据目的蛋白目的条带选择合适的蛋白胶浓度，再根据标准Marker条带大小取所需要的蛋白条带，转移到NC 膜上牛奶封闭，孵育一抗；洗涤，孵育二抗；洗涤，滴加蛋白显影液后于显影仪上显影。

1.2.6 统计学分析 所有数据用T检验的方法进行显著性分析统计差异，*P<0.05即具有统计学差异。利用Graphpadprism 7制图。

2 结果

2.1 POPDC2在肺癌组织中的表达

使用GEPIA平台对公共数据库TCGA中LUAD和LUSC的mRNA表达水平进行分析。选取483例LUAD和486例LUSC癌组织，另取相应的癌旁正常组织作为对照，对POPDC2在不同组织中的表达水平进行分析。结果发现，相比于对照，POPDC2在LUSC和LUAD中显著下调(图1)。

T：肺癌组织；N：癌旁正常组织；*P<0.05。

2.2 pCMV-tag2B-POPDC2质粒在A549细胞系中表达POPDC2蛋白

将pCMV-tag2B-POPDC2质粒转染到A549中，表达48 h后提取总蛋白，使用POPDC2特异性抗体进行免疫印迹实验。结果表明POPDC2蛋白表达水平显著提高(图2)。

图2 POPDC2在A549中过表达

2.3 POPDC2影响细胞凋亡

在长满的A549细胞中分别转染空载质粒和pCMV-Tag2B-POPDC2过表达质粒48 h后，使用流式细胞术检测发现转染POPDC2过表达质粒的细胞，凋亡数目比例显著增加(图3)。

图3 过表达POPDC2后细胞凋亡情况

2.4 POPDC2对凋亡相关基因的影响

p53,beclin和LC3A/B是细胞凋亡和自噬的重要标志性基因。对转染了空载和pCMV-tag2B-POPDC2质粒的A549细胞提取总RNA，使用qPCR检测其mRNA表达变化情况。结果表明，过表达POPDC2会显著上调A549细胞中的p53，beclin和LC3A/B的转录水平(图4)。

数据来自3组实验重复，*P<0.05，****P<0.0001。

随后提取总蛋白，通过WB检测这3个基因的蛋白表达差异。结果表明，过表达POPDC2后，p53，beclin和LC3A/B的蛋白水平均显著增加(图5)。

2.5 POPDC2对MAPK信号通路相关基因的影响

MAPK信号通路异常与癌症发生紧密相关，JNK和P38作为该通路中的分子标记，与细胞生长、凋亡都有关。对过表达POPDC2后的样品检测其JNK，P38以及相应的蛋白磷酸化水平。结果发现，JNK和P38蛋白表达较于对照没有发生明显变化，但是二者的磷酸化水平都发生了显著上调(图6)。

a：凋亡/自噬相关基因在过表达POPDC2后的蛋白差异表达;b：蛋白表达量化统计。数据来自3组实验重复，*P<0.05。

a：MAPK通路相关基因在过表达POPDC2后的蛋白水平，b：磷酸化蛋白表达量统计。数据来自3组实验重复，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

本研究使用TCGA数据库首次分析了POPDC2在LUAD和LUSC中的表达情况。数据显示，POPDC2在两种肺癌亚型中都有所下调，提示POPDC2和肺癌之间具有一定的关联。一项对49例非小细胞肺癌患者癌组织的POPDC1基因甲基化水平检测研究中发现，相对于正常组织，癌组织甲基化频率显著增加[15]。POPDC3表达也是影响胃癌患者预后的独立因素。有研究表明，在306例胃癌患者中，存在228例POPDC3低表达。使用Kaplan-Meier法进行生存分析显示，低表达POPDC3的早期胃癌患者3年生存率降低51.9%，晚期胃癌患者为32.6%[16]。研究提示POPDC2可能与直肠癌发生存有相关，在耐药结性直肠癌细胞系中，POPDC2表达水平较低[17]。这一结果与本研究的生物信息学分析相一致，说明POPDC2与肺癌的发生可能相关。

cAMP是一种普遍存在的第二信使，通过蛋白激酶A (protein kinase A system，PKA)的激活调节多种细胞生物学过程[18]，包括细胞周期阻滞、自噬、迁移、凋亡[19]。淋巴细胞中cAMP的长期升高可促进淋巴样细胞的生长阻滞和凋亡，尤其是不成熟淋巴样细胞。使用霍乱毒素在小鼠T淋巴瘤细胞增加cAMP水平能诱发细胞凋亡[20]。在As2O3诱导凋亡的人乳腺癌细胞中，POPDC2基因的表达显著上调[21]，提示POPDC2可能参与癌症化疗诱发的细胞凋亡。笔者使用流式细胞术分析也证实，过表达POPDC2能促进A549细胞凋亡，与同行们在乳腺癌中的研究结果相一致，提示POPDC2可能通过促进细胞凋亡的作用，抑制肺癌的发生。

POPDC2对肺癌的促凋亡作用机制可能是通过JNK和P38实现的。有研究发现，JNK和P38的活化能诱发细胞凋亡。使用甘草查尔酮A处理人鼻咽癌细胞系NPC-BM后JNK和P38磷酸化水平显著增加，通过MTT法检测发现癌细胞活力显著降低，同时伴随着细胞凋亡显著增加[22]。使用棕榈酸酯处理人肝癌细胞系Huh-7后，死亡受体DR5mRNA水平显著上调，JNK蛋白磷酸化水平显著上升[23]。在人结肠癌细胞系HCT-116中失活P38会阻断三酰基甘油的合成，减缓细胞凋亡过程中脂滴的聚集[24]，表明P38能介导结肠癌的细胞凋亡。笔者通过免疫印迹检测同样发现POPDC2过表达显著增加了P38和JNK蛋白磷酸化水平。提示POPDC2过表达激活P38和JNK蛋白磷酸化，随后诱导A549肺癌细胞凋亡。

p53也是细胞凋亡的重要调控因子。p53的调控与P38的活性有关，有学者使用依托泊苷诱导MCF-7细胞构建DNA损伤模型后，发现细胞凋亡的同时，p53蛋白水平显著上调并伴随着P38的磷酸化水平显著增加[25]。本研究也显示，过表达POPDC2的肺癌细胞中p53表达上调，但其调控的具体分子机制尚不明确。此外，beclin1和LC3A/B可以通过调节细胞自噬影响细胞凋亡。JNK的活化参与细胞自噬的调控。研究发现，在人肝癌细胞HCC中过表达骨形态发生蛋白BMP4后，beclin1和LC3蛋白水平上调，且伴随着JNK的磷酸化激活，随后使用JNK高选择性抑制剂SP600125处理发现beclin1和LC3的表达显著降低[26]。在过表达POPDC2的肺癌细胞中，beclin1和LC3A/B蛋白水平显著上调，这有可能是JNK信号被活化的缘故。但是，JNK相关的自噬在POPDC2促凋亡过程中发挥多大作用及其作用机制尚不清楚,值得进一步研究。

综上所述，本研究证实POPDC2促进肺癌细胞凋亡。在肺癌的病理发生中，POPDC2的表达下调有可能丧失其对肺癌细胞的促进作用从而调控肺癌的发生，本研究为临床诊断和干预肺癌的发生提供了新的分子靶标。