遗传改造乳酸链球菌合成Nisin的研究进展

罗林根，穰 杰，夏立秋*

(1.湖南师范大学生命科学学院，中国 长沙 410081；2.临湘市第一中学，中国 岳阳 414000)

乳酸链球菌素( Nisin)是由乳酸链球菌产生的一类小分子肽，具有广谱抑菌作用，不仅对致病性病原体如李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、芽胞杆菌等革兰氏阳性菌具有抗菌活性，还能缓解由部分微生物引起的食品腐败变质问题。由于Nisin具有抑菌效果好、热稳定性高以及对人安全无毒等优点，早在1969年就被世界卫生组织(WHO) 批准用作食品防腐剂，随后于1988年被美国食品药品监管局(Food Drug Administration,FDA)列入GRAS (一般认为安全) 名单。目前，Nisin作为一种国际公认的安全无毒的天然防腐剂，已被商业化广泛应用[1]。

Nisin的分子结构已于1971年得到解析，其分子式为C143H228N42O37S7，相对分子质量为3 500，一般以二聚体(7 000)或四聚体(14 000)结构存在。Nisin主体结构由34个氨基酸残基构成，并通过硫醚键连接成五环结构，共涉及11种常见氨基酸和4种稀有氨基酸。在此基础上，通过氨基酸修饰可产生不同Nisin变体。目前，已有8种天然Nisin变体(Nisin A，Nisin Z，Nisin F，Nisin Q， Nisin H，Nisin P，Nisin U和Nisin U2)被报道，其中Nisin A和Nisin Z研究最为广泛[2]。

Nisin作为一种无毒的天然防腐剂，需求量一直持续增长，然而由乳酸链球菌生产的Nisin存在发酵活力、产量较低以及生产成本高等问题，严重限制它的商业化推广应用。发酵培养基优化是促进乳酸链球菌合成Nisin的重要手段。吴疆等根据代谢发酵控制原理，采用二次回归正交旋转组合设计，研究了乳酸链球菌摇瓶发酵培养基中蔗糖、蛋白胨、酵母浸出物以及KH2PO3等4种主要成分对Nisin产量的影响，通过DPS软件优化其添加比例，显著提高Nisin的产量[3]。通过培养基优化虽然能促进Nisin的合成，但其产量远没有达到工业化生产要求。目前，对参与目标天然产物生物合成的相关基因进行定向遗传改造或代谢途径优化是促进其生物合成的主要方法，并在许多重要天然产物生产菌中广泛应用。

1 乳酸链球菌基因组特征

近年来，利用全基因组测序与生物信息学方法对乳酸链球菌进行遗传背景的解析为乳酸链球菌的进一步开发提供了广阔的研究空间。自Bolotin等[4]在2001年发布了第一株名为乳酸链球菌乳酸亚种IL1403菌株的全基因组序列以来，总共有235株乳酸链球菌及其亚种的全基因组完成图或草图得到公布，基因组大小在1.71～2.96 Mb，GC含量在34.5%～38.6%[5-7](表1)。以乳酸链球菌乳酸亚种IL1403为例，该菌株基因

表1 部分已完成测序的乳酸链球菌基因组信息比较

组大小为2.37 Mb，GC含量为35.3%，共编码2 219个蛋白质，19个rRNA，63个tRNA以及其他4个非编码RNA。对所编码蛋白质的生物学功能进行分析，发现该菌株含有全部20种氨基酸的生物合成途径[4]。在对已测序的乳酸链球菌基因组进一步分析发现，部分菌株还存在多个质粒，如乳酸链球菌乳酸亚种KF147的基因组由一条染色体DNA和1个质粒组成[8]，而乳酸链球菌乳酸亚种SD96的质粒数目达到了10个[9]，从而赋予不同乳酸链球菌亚种独特的生物学功能。此外在乳酸链球菌基因组中还存在多个前噬菌体序列和插入序列，如乳酸链球菌乳酸亚种MG1363的基因组存在多达134 kb前噬菌体序列和92个插入序列[10]。这些序列的存在可引起高频率的基因水平转移，这可能是乳酸链球菌在适应复杂的营养环境过程中，导致染色体大小发生变化的重要原因。

2 Nisin生物合成基因簇及合成途径

全基因组测序结果显示，在乳酸链球菌基因组中存在一个大小为14 kb的基因簇nisABTCIPRKFEG，并已证明这11个基因都参与了Nisin的合成[11](图1A)。其中nisA编码了含有57个氨基酸残基的Nisin前体肽，随后Nisin前体肽中的丝氨酸和苏氨酸在脱水酶NisB和环化酶NisC的催化下脱水生成Dha和Dhb残基并与半胱氨酸偶联，形成甲基羊毛硫氨酸环[12](图1B)。完全修饰的Nisin前体在转运蛋白NisT(属于ABC转运蛋白家族)的作用下可以跨膜运输到细胞外，同时在胞外蛋白酶NisP的作用下对Nisin前体进行前导肽的切割最终形成成熟且有活性的抗菌肽[13]。由于Nisin具有强烈的抑菌性，在长期进化过程中乳酸链球菌产生了一种自我保护的机制，如在脂蛋白NisI和ABC转运蛋白NisFEG的协同作用下，一方面通过直接结合Nisin，防止其与脂质体Ⅱ分子结合在细胞膜上形成小孔，另一方面，ABC 转运蛋白 NisFEG能够把入侵细胞膜的Nisin分子排出到细胞外，减少进入细胞膜的Nisin分子数量，从而防止Nisin分子局部浓度过高形成孔洞等，避免自身受Nisin的侵害[14]。另外，该基因簇中还存在调控Nisin合成的蛋白，如NisR和NisK。当细胞外出现成熟的Nisin分子时，它会与NisK结合，引发该蛋白组氨酸磷酸化，并将磷酸基团转移至NisR上使其磷酸化，最终激活nis基因簇上相应基因的转录调控[15]。

图1 Nisin生物合成基因簇及其编码产物(A.nis基因簇结构及其启动子位置示意图；B. Nisin结构)

3 代谢工程改造促进乳酸链球菌Nisin的合成

与培养基优化相比，代谢工程定向改造在提高菌株次生代谢产物合成能力上具有更强的目的性。在改造策略上可以选择对目标次生代谢产物进行基因簇多拷贝、正调控基因过表达、负调控基因阻断以及优势基因异源表达等。

3.1 增加Nisin基因簇中关键基因的拷贝数

研究发现增加直接参与Nisin生物合成基因的拷贝数可促进Nisin的产量，增加参与Nisin生物合成调控与抗性基因的拷贝数(nisRK和nisFEG)，也可达到相同的效果[16]。虽然Nisin在其自身的生物合成中是作为诱导剂发挥作用，但乳酸链球菌的正常生长却受到了Nisin的不利影响。特别是在发酵的后期，生长培养基中大量Nisin的积累会对乳酸链球菌产生反馈抑制作用。由于乳酸链球菌可通过产生脂蛋白NisI和转运蛋白NisFEG来保护自己，因此，通过增加乳酸链球菌中Nisin耐药基因(nisI和nisFEG)的表达，可使细胞对Nisin的耐药性增强，从而避免自身受Nisin的影响[17]。Stein等人将含有nisI的重组载体导入野生型乳酸链球菌后，使得Nisin的产量提高20%，同时，nisI拷贝数的增加还促使nis基因簇中其它基因的表达量增强[14]。有研究人员在对乳酸链球菌乳酸亚种164菌株进行遗传操作时，通过对结构基因nisZ、调控基因nisRK和抗性基因nisFEG进行共表达，使得Nisin Z的活性由16 000 AU·mL-1增强到25 000 AU·mL-1[18]。在其他的研究中发现，同时提高nisRK和nisFEG的拷贝数，可使Nisin的产量提高45%[19]。

3.2 提高乳酸链球菌对低pH值发酵液的耐受性

由于乳酸链球菌在发酵过程中会产生乳酸，导致发酵液pH值会逐渐降低，使得细胞出现自溶或释放蛋白酶，进而抑制Nisin产量，因此提高菌株对乳酸的耐受性对提高其产量有促进作用[20]。解决这个问题的关键是克隆和表达丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶基因，以促进乳酸链球菌将碳水化合物代谢生成乙醇。Wardani等人的研究结果显示，通过相应修饰可使Nisin的产量提高1.7倍[21]。同时有研究发现通过增加天冬酰胺合成酶基因的拷贝数来提高乳酸链球菌细胞壁组成中D-Asp酰胺化的比例，可使重组菌株对环境中酸性条件的耐受性明显提高，从而提高Nisin的产量。在分批发酵和补料分批发酵中，重组菌株F44A的Nisin产量分别提高到3 405 IU·mL-1和5 346 IU·mL-1[22]。此外，Zhang等将17个与耐酸相关的基因在乳酸链球菌F44中进行异源表达或过表达来维持细胞内最佳pH值。其中，过表达hdeAB，ldh和murG基因的工程菌株在发酵过程中，菌株的耐酸能力显著提高，细胞内pH值更稳定且Nisin产量提高到5 560 IU·mL-1[23]。

3.3 提高乳酸链球菌整体代谢能力

一般而言，Nisin的产量取决于发酵过程中乳酸链球菌的生物量，高浓度、高活性生产细胞的存在可显著促进目标代谢产物的合成。因此，有许多研究旨在增加发酵条件下的乳酸链球菌基础代谢能力，从而获得生产性能高的工程菌。如Papagianni等人[24]将黑曲霉中与能量代谢相关的aox1基因在乳酸链球菌中进行异源表达，使细胞产生更多的能量，加速细胞分裂和代谢，最终使菌株生物量由3.2 g·L-1提高到5.8 g·L-1，Nisin的产量由5 900 IU·mL-1增加到7 900 IU·mL-1。他们又将pfk13-pkaC-aox1基因同时在乳酸链球菌中进行表达，通过提高菌株对发酵液中碳源的利用和能量生成，使得菌株生物量达到7.5 g·L-1，Nisin活性达到14 000 IU·mL-1。除上述研究来促进Nisin的合成外，有研究人员还借助基因组重排技术来提高Nisin产量，所获得的突变株F44能耐受高浓度的葡萄糖(8%～15%)和Nisin (5 000～14 000 IU·mL-1)，最终使突变株Nisin的产量提高了2.4倍[25]。

4 合成生物学技术在改造乳酸链球菌合成Nisin中的策略

单个基因修饰在一定程度上能够促进目标次生代谢产物生物合成，但次生代谢产物合成途径通常相对复杂，受到多个代谢途径和转录因子共同控制。通过对单个基因进行修饰可能只会增加部分酶的表达量，对整个代谢途径的影响不明显，甚至中间产物的过度积累有时可能会对Nisin生物合成起抑制作用，导致难以按照确定的目标进行设计或设计的系统不稳定，因此，亟需采用新的遗传改造策略来提高Nisin的产量。近年来，合成生物学的兴起和发展使得对微生物进行遗传改造进入到一个全新的阶段，研究主流也从单一基因的设计扩展到对多个代谢途径进行改造。通过深度挖掘高效功能元件，重构代谢网络，优化元件与底盘的适配性，并对代谢网络流量进行精细调控，从而构建基于人工基因线路的定制化细胞来实现药物与功能材料或目的化合物的大规模生产及应用[26]。

4.1 优势底盘细胞构建

在特定环境中，维持细菌正常代谢所需的必需基因构成了该菌株的最小基因组。采用最小基因组作为底盘微生物进行目标产物的合成，可减少本底其他不必要的代谢路径对底物、能量和还原力的消耗。已公布的微生物全基因组测序结果显示，基因组中存在大量的编码非目标产物的基因簇、前噬菌体序列、转座酶和插入序列等，这些基因元件的存在很可能干扰目标产物的合成与检测，同时导致菌株遗传物质不稳定[27]。因此优势底盘细胞的开发最重要的策略就是对目标菌株进行基因组精简和优化，并在很多微生物合成生物学改造中得到了广泛应用。如枯草芽胞杆菌PG10与野生型枯草芽胞杆菌相比，其基因组已缩减36%，但该突变株克服了与分泌过程和分泌产物不稳定性有关的蛋白质生产的几个瓶颈，显著提高细菌表达宿主分泌蛋白的产量[28]。研究发现慢病毒在大肠杆菌中进行克隆时往往表现出极大的不稳定性，导致难以获得有效的克隆，Chakiath等人[29]对大肠杆菌基因组进行缩减后，有效地促进了慢病毒表达载体在细胞内的重组稳定性。Zhou等人[30]敲除了天蓝色链霉菌体内所有的10个PKS，NRPS基因簇以及900 kb的端粒序列，并在该底盘内实现了放线紫红素的过表达。已公布的乳酸链球菌全基因组测序结果显示，其基因组不仅存在一定的可塑性(1.71～2.96 Mb)，还包括多个非必须基因区域、前噬菌体序列和插入序列等，对其进行精减，可极大减少本底非必须代谢途径对底物、能量和还原力的消耗以及维持菌株的遗传稳定，从而显著促进Nisin的合成。

4.2 前体合成途径优化

目标产物在宿主细胞中合成不足，很有可能是由于宿主内某些底物或前体供应不足。可以通过组合生物合成的方法对宿主菌代谢途径进行改造和优化，以满足目标产物合成所需底物和前体的供应。如果通过基因组精简来敲除和沉默原有基因簇的手段是“节流”，那么通过改造和优化代谢途径来增加底物和前体含量的方法可称之为“开源”，这种方法需要对宿主菌的整个代谢网络有比较深入的了解，才能够进行合理的改造。孙伟康等人[31]基于基因组功能注释和比较基因组学构建了乳酸链球菌的首个基因组规模代谢网络模型，该模型共涉及557个基因，668个代谢物，840个反应，并进一步在定性和定量两个层次验证了模型的准确性，较为全面地揭示了乳酸链球菌的代谢特点，为乳酸链球菌的前体合成途径改造和优化提供了良好的工具。基于Nisin的结构解析可知，其生物合成至少涉及14种常见氨基酸和4种稀有氨基酸。结合基因组规模代谢网络模型，可将涉及上述氨酸酸合成的代谢通路增强、竞争性代谢通路阻断等来优化前体合成途径，从而提高Nisin的合成能力。

5 总结与展望

Nisin是唯一被批准用于食品工业的细菌素，其主要用于肉制品、乳制品、生鲜果蔬的保鲜。现阶段Nisin主要通过微生物发酵生产，然而野生型菌株Nisin的合成量远不能满足工业化生产需求。发酵工艺优化以及对关键功能基因进行过表达是促进乳酸链球菌合成Nisin的重要措施，但并没有显著提高Nisin的产量。近年来，合成生物学技术在提高目标产物产量上有着发酵工艺和代谢工程改造所无法具备的优点，也是研究者们不断关注的热点。多株乳酸链球菌全基因组测序数据的公布以及基于乳酸链球菌基因组规模代谢网络模型的构建，使得研究人员能够将乳酸链球菌作为一个整体来研究，从而获得与Nisin生物合成密切相关的合成途径与代谢调控网络，为挖掘高效功能元件、确认合成途径中关键功能基因和代谢途径奠定重要基础。多种基因组编辑技术的出现，如CRISPR/Cas9技术、Red/ET同源重组技术、Cre/loxP位点特异性重组技术等，可为乳酸链球菌进行合成生物学改造提供重要编辑工具，为促进乳酸链球菌Nisin的生物合成带来全新的机遇。